Zn2+、Cu2+对翅碱蓬生长的影响研究

赵雨朦，魏海峰*，李 悦，范诗文，牛禹霁， 刘长发，张明亮，何 洁，夏 宁，赵肖依

(1. 辽宁省近岸海洋环境科学与技术重点实验室，辽宁 大连116023； 2. 大连海洋大学，海洋科技与环境学院，辽宁 大连116023； 3. 大连海洋大学，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连116023)

重金属污染是目前最为严峻的土壤污染问题。土壤中的重金属会引起植物叶肉细胞超微结构的毒害效应，抑制细胞核分裂、细胞膜的渗透机制紊乱失调、破损、抗氧化酶系统损伤等[1-5]。有调查显示，我国土壤污染超标率高达16.1%，污染类型以重金属污染为主，其污染物不仅包括 Cd、Cr 等植物非必需的元素，还包括 Cu、Zn 等植物必需的微量元素，在 Cu、Zn 过量时也会对植物产生危害[6-7]。此外重金属是一类典型的累积性污染物，可通过食物链逐级传递富集，并在某些条件下转化为毒性更大的金属有机化合物，严重危害植物和人类健康。锌作为植物生长发育的必需生长元素，当植物体内锌浓度超过一定阈值，其主要作用由营养转为毒害，抑制植物生长[8]。此外植物体内锌过量还会引起其他必需元素缺乏，进而影响植物的一系列正常生理代谢活动[9]。铜不仅参与植物的光合作用，更是多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、抗坏血酸氧化酶等多种酶类的结构成分和催化活性成分，其对于植物的生长发育过程同样有重要意义。但过量的铜会对植物同样会产生毒害作用，使植物的水分代谢、光合作用、呼吸作用等各项生理代谢发生紊乱，生长缓慢，阻滞生长发育，降低产量，并可在食用部位积累，对人类健康造成严重危害[10-11]。

翅碱蓬为耐盐性草本植物，其作为北方滩涂的优势种植物[12]，是一种典型的盐碱地指示植物，具有良好的经济开发潜力和生态价值[13-14]。盘锦红海滩位于辽河入海口，依托于滨海湿地而存在，火红的碱蓬草成为红海滩得天独厚的资源，但近年来由于各种污染加剧，翅碱蓬出现大面积死亡的现象。为探究其死亡原因，目前已有很多学者做出相关研究，但对于锌、铜这些植物所必需的微量元素对翅碱蓬生长影响的研究较少。因此，以翅碱蓬为研究对象，研究在不同Zn2+、Cu2+浓度处理下其生长及生理指标的变化情况，以期为湿地生态环境修复提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用翅碱蓬种子取自辽宁省盘锦市大洼区赵圈河镇。所用纯水由实验室纯水机制出。

1.2 试验方法

选择大小一致、饱满的种子在实验室进行水培养。在种子萌发后长至一定高度(5 cm)后，选择长势一致的翅碱蓬幼苗，将其移栽至更有助于翅碱蓬直立生长的内置经过75%酒精消毒的太空棉的容器中。生长至20天左右，在翅碱蓬已经有一定高度(约10 cm)时，分别加入同体积的不同浓度(0.1、5、10、50 mg/L)Zn2+和Cu2+溶液，并且设置同体积营养液为对照组，各做三组平行试验。营养液配置方法参照霍格兰营养液配置并有所改进，具体成分见表1、2。本试验为了保证翅碱蓬不受病害和污染的影响，以及重金属溶液浓度的恒定，每隔三天更换一次培养液，且将幼苗放置于室内有光照的地方。每五天测定翅碱蓬生理生化指标一次，包括花青素、叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量和植株含水率，共进行35天。

表1 营养液成分中大量元素浓度Table 1 The concentration of macronutrients in nutrient solution

表2 营养液成分中微量元素浓度Table 2 The concentration of microelements in nutrient solution

1.3 指标测定

(1)含水率

每个浓度梯度分别取三株翅碱蓬，记录编号，沥干表面水分，分析天平称重，记录数据(鲜重)；将所有样品放置在培养皿中，放入烘箱105oC下烘干3 h；取出培养皿，冷却至室温，用分析天平称重，记录数据(干重)。

(2)花青素含量测定参照于晓楠(2000年)试验方法[15]，并有所改进。

取整株样品，记录鲜重后用组织匀浆器充分研磨后，用3 mL的0.1 mol/L盐酸乙醇溶液冲洗组织研磨器，将内容物尽量冲出，移至比色管中，室温下浸提1 h。

将比色管中液体移入比色皿中，用中速滤纸和漏斗进行过滤，取澄清滤液，用752N紫外分光光度计分别测定在530、620、650nm波长下的吸光度A530、A620、A650；用下列公式计算花青素含量。

花青素光密度值：OD =(A530-A620)-0.1*(A650- A620)

式中：ξ——摩尔消光系数(46200)

m——翅碱蓬质量(g)

V——提取液体积(mL)

(3)叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量测定参照杨喜珍(2019年)实验方法[16]。

取整株样品，记录鲜重后用组织匀浆器充分研磨后，用10 mL的95%乙醇冲洗至25 mL比色管中，静置30 min以完成光合色素的提取。

用中速滤纸和漏斗进行过滤，取澄清滤液，用752N紫外分光光度计分别于649 nm和665 nm波长下测定吸光度值，记为A649、A665。

叶绿素浓度计算公式：

叶绿素a浓度C(chl-a)=13.95×A665-6.88×A649

叶绿素b浓度C(chl-b)=24.96×A649-7.32×A665

总叶绿素浓度C(chl)=C(chl-a)+C(chl-b)

求得色素浓度后，按下式计算单位鲜重各色素含量：

式中：c——色素浓度(mg/L)

V——提取液体积(L)

n——稀释倍数

m——样品鲜重(g)

1.4 数据处理

利用Excel 2010进行数据处理，用SPSS19.0统计分析试验数据，对不同浓度处理组之间的差异进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬含水率影响

如图1所示，翅碱蓬含水率随时间变化未出现明显的变化趋势。通过观察可以发现，与对照组相比，不同浓度的Zn2+处理组对翅碱蓬的含水量均产生促进作用；但随着Zn2+浓度的增加，促进效果逐渐减弱。以第20天为例，当Zn2+浓度为0.1 mg/L时含水率最高，相比于对照组提高了8.0%；当Zn2+浓度为50 mg/L时，其相比于对照组提高了4.5%。

图1 不同Zn2+浓度下的翅碱蓬含水率Fig. 1 Moisture content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+注：同列(行)中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P < 0.05)，下同。

由图2可知，翅碱蓬含水率随时间变化未出现明显的变化趋势。但通过观察可以发现，在同一天中与对照组相比，不同浓度Cu2+处理组对翅碱蓬含水量均产生抑制作用，且随Cu2+浓度升高抑制作用逐渐增强。

图2 不同Cu2+浓度下的翅碱蓬含水率Fig. 2 Moisture content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

2.2 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬花青素含量影响

如图3所示，翅碱蓬中花青素含量随时间变化未出现明显的变化趋势。通过观察数据图可以发现，除第15天外，低浓度的Zn2+对花青素的合成有一定的促进作用，但未表现出明显的规律。

图3 不同Zn2+浓度下翅碱蓬的花青素含量Fig. 3 Anthocyanin content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

由图4可知，翅碱蓬体内花青素含量随时间变化而升高。同一天中花青素含量随Cu2+浓度增加先升高再降低，且均高于对照组；当Cu2+浓度为10 mg/L时，促进作用最明显。这说明在适宜浓度范围内Cu2+对花青素的合成起促进作用；若继续增加Cu2+浓度，超过适宜浓度范围，花青素的合成将会受到抑制。

图4 不同Cu2+浓度下翅碱蓬的花青素含量Fig. 4 Anthocyanin content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

2.3 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬叶绿素a含量影响

由图5可知，叶绿素a含量随时间变化呈现出先升高后降低的趋势，在第25天叶绿素a含量达到最高。在同一天中随着Zn2+浓度升高，叶绿素a含量先增加后减少。以第25天为例，当Zn2+浓度为0.1 mg/L时，叶绿素a含量相比于对照组提高了45.21%；当Zn2+浓度为50 mg/L时，其含量相比于对照组降低了5.11%。这说明Zn2+对叶绿素a合成的影响表现为低浓度促进、高浓度抑制。

图5 不同Zn2+浓度下翅碱蓬的叶绿素a含量Fig. 5 Chlorophyll a content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

如图6所示，翅碱蓬体内叶绿素a含量随时间变化基本呈现出先增加后减少的趋势，在第25天叶绿素a含量达到最高。从第15天开始低浓度的Cu2+对叶绿素a的合成有一定的促进作用，但未表现出明显的变化规律。

图6 不同Cu2+浓度下翅碱蓬的叶绿素a含量Fig. 6 Chlorophyll a content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

2.4 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬叶绿素b含量影响

如图7所示，翅碱蓬体内叶绿素b的含量随时间变化先增加后减少，在第25天达到最大值。同一天中叶绿素b含量随Zn2+浓度先增加后减少，同样表现出低促高抑的现象，与叶绿素a类似。此外如图8所示，以第20天为例，可以发现叶绿素a与叶绿素b的比值随Zn2+浓度增加而降低。

图7 不同Zn2+浓度下翅碱蓬的叶绿素b含量Fig. 7 Chlorophyll b content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

图8 第20天不同Zn2+浓度下的叶绿素a/b值Fig. 8 Ratio of chlorophyll a to chlorophyll b at different Zn2+ concentrations on the twenty day

由图9可知，Cu2+对叶绿素b合成的影响未表现出明显趋势。此外如图10所示，以第20天叶绿素a与叶绿素b比值为例，可以发现叶绿素a/b值随Cu2+浓度增加而减小，相关方程及系数分别为y=-0.3112x+2.3734，R2=0.7453。

图9 不同Cu2+浓度下翅碱蓬的叶绿素b含量Fig. 9 Chlorophyll b content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

图10 第20天不同Cu2+浓度下的叶绿素a/b值Fig. 10 Ratio of chlorophyll a to chlorophyll b at different Cu2+ concentrations on the twenty day

2.5 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬叶绿素总量影响

由图11可知，翅碱蓬体内总叶绿素含量随时间变化先增加后减少，在第25天总叶绿素含量达到最高。此外在同一天中，总叶绿素含量随Zn2+浓度升高先增加后减少，当Zn2+浓度在0.1～5 mg/L范围时，总叶绿素含量最高；若Zn2+浓度继续增加，则总叶绿素含量开始降低。

图11 不同Zn2+浓度下翅碱蓬的总叶绿素含量Fig. 11 Total chlorophyll content of S. heteroptera under different concentrations of Zn2+

如图12所示，翅碱蓬中叶绿素总量随时间先增加，在第25天后开始减少。此外还可以发现同一天中，翅碱蓬体内叶绿素总量随Cu2+浓度升高而增加。

图12 不同Cu2+浓度下翅碱蓬的总叶绿素含量Fig. 12 Total chlorophyll content of S. heteroptera under different concentrations of Cu2+

3 讨论

3.1 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬含水率的影响

锌是植物生长发育的必需元素。但过量的锌会使根系生理代谢过程失调，植物根系生长受到抑制，从而导致根系吸收能力减弱，使植物缺乏营养。根系是植物吸收水分和矿质营养的重要器官[17]，因此植物体内含水量的大小与根系的生长情况有直接联系。试验结果表明，在试验所设的浓度范围内(0～50 mg/L)，Zn2+对翅碱蓬体内的含水率均有促进作用，促进效果随着Zn2+浓度的增加先增强后减弱。由此推断，若继续增加Zn2+浓度，高浓度的Zn2+将对翅碱蓬的含水率产生抑制作用。有研究表明[18]，低浓度Zn2+对盐地碱蓬根系活力有促进作用；当Zn2+浓度超过0.4 g/L时，Zn2+开始对根系活力呈现抑制作用，这与本试验结果一致。低浓度Zn2+使根系活力增强的原因可能是，其作为甘油醛-3-磷酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的组成成分，进入细胞后使酶的合成量增加，酶活性增强，根系活力随之增强[18]。但过量的Zn2+会伤害植物根系，使植物根系生长受到阻碍，过量的Zn2+还会使植物地上部分出现褐色斑点并坏死[19-20]。

试验结果表明，不同浓度的Cu2+(0～50 mg/L)均对翅碱蓬含水量产生抑制作用。Sheldon等人发现不同浓度Cu2+使罗德草(ChlorisgayanaKnuth.)的根毛数量和长度减少，根部明显受损，分生组织被损害[21]。此外当植物体内Cu2+过量时，随着Cu2+在根部沉积，根系生长将进一步受到抑制[22]。祝沛平等[23]研究认为，过量的Cu2+将抑制脱羧酶活性，最终造成根部大量NH4+的积累，植物根部损伤严重，主根伸长受到抑制，根尖出现硬化，生长点细胞分裂受到抑制，根毛数量减少甚至枯死。

3.2 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬花青素含量的影响

花青素是植物次级代谢产物类黄酮中的一种重要的水溶性色素。类黄酮分子结构上的酚羟基可以通过自身氧化释放电子，直接清除自由基，起到抗氧化的作用[24]。因此植物组织在受到逆境刺激发生氧化胁迫时，花青素可以保护叶片降低其受到光抑制、氧化或动物啃食等伤害程度[25-26]。试验结果表明，作为植物必需的营养元素，低浓度的Zn2+和Cu2+对花青素的合成均有促进作用。若继续增加Zn2+和Cu2+浓度，植物将会受到重金属胁迫，体内的抗氧化酶活性下降或抗坏血酸耗尽，此时花青素含量仍然上升，通过清除H2O2以维持细胞内的氧化还原平衡[27-28]。但如果重金属浓度超过植物可耐受的最大限度，其对植物的毒害作用就会表现出来，最终导致机体死亡。

3.3 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬叶绿素含量的影响

叶绿素是植物光合作用中最重要的色素，是植物能否通过合成有机化合物将光能转变为化学能的关键。其在高等植物中主要以叶绿素a和叶绿素b的形式存在。锌在叶片中大多数以自由离子、低分子化合物和金属蛋白存在，也有少部分和细胞壁结合，呈现不溶的形态，植物中可溶的Zn2+是引起生理作用的主要形态[29]。试验结果表明，随着Zn2+浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量均呈现出先增加后减少的趋势，当Zn2+浓度在0.1～5 mg/L范围时，叶绿素含量最高。即低浓度的Zn2+促进叶绿素合成，高浓度的Zn2+抑制叶绿素合成。锌作为植物生长所需的元素，参与叶绿素的合成过程，并且低浓度的Zn2+会加速叶绿素的合成。但如果Zn2+浓度过高，其将会改变植物对铁的利用性。铁的利用对叶绿素形成起着决定性的作用，一旦叶绿素的形成受到抑制，会大大影响植物光合作用，从而使叶片失绿，减少干物质产量[30-31]。此外，刘茵[32]等也发现锌对植物光合作用的影响的直接表现便是植物叶绿素含量降低，这与本试验结果一致。

铜也是植物生长发育过程中一种必需元素，但过多的铜同样会抑制植物光合作用，且引起叶色失绿，从而抑制植物生长[33]。试验结果表明，在试验所设的浓度范围内(0～50 mg/L)，不同浓度的Cu2+对翅碱蓬体内叶绿素的合成均起促进作用。其原因可能是，铜作为植物生长必需的元素，低浓度的Cu2+有利于植物体内叶绿素的合成。此外植物对外部环境有一定的防御性，低浓度的Cu2+刺激叶绿素含量增加，这可能与翅碱蓬本身的抗性机制有关。细胞内的金属蛋白结合了外来的有毒金属离子，从而使重金属的毒害作用被解除[33]。但如果Cu2+浓度过高，其毒害作用就会表现出来。过量的Cu2+与合成叶绿素的某些酶(原叶绿素酸酯还原酶、胆色素原脱氨酶和8-氨基乙酰丙酸合成酶)的-SH结合，改变了酶的结构[34]，阻碍了叶绿素前体的合成，导致叶绿素分解；或Cu2+直接破坏叶绿体结构阻碍叶绿素合成，导致叶绿素含量降低[33]。朱健等人[35]研究铜对海花菜生长的影响时发现，当Cu2+浓度在 0.1～10 mg/L范围内时，海菜花幼苗中叶绿素含量随 Cu2+处理浓度的增加而逐渐降低，与本文的试验结果不一致。其原因可能是不同植物对于Cu2+的耐受性存在差异，因此需要进一步研究。

3.4 Zn2+、Cu2+对翅碱蓬叶绿素a/b值的影响

叶绿素a主要吸收红光，叶绿素b主要吸收蓝紫光。叶绿素循环是植物在不同生理条件下实现的叶绿素a和叶绿素b间的相互转化[36]。叶绿素a/b值可以表征叶片的老化，其值越小，表明叶片老化越严重[37]。试验结果表明，以第20天为例，随着Zn2+、Cu2+浓度的升高，不同处理组中叶绿素a/b的值减小。这说明重金属对叶绿素a合成的抑制作用大于对叶绿素b合成的抑制作用，并且在重金属胁迫下叶绿素a的降解速率大于叶绿素b的降解速率。此外，在重金属的胁迫下，植物可能通过加快叶绿素a向叶绿素b的转化而增加对弱光的利用，从而抵抗胁迫对其生长的影响[36]。

4 结论

锌和铜作为植物必需的营养元素，低浓度的Zn2+和Cu2+作用于翅碱蓬时，对翅碱蓬的生长，花青素、叶绿素的合成产生促进作用。当环境中Zn2+和Cu2+浓度不利于翅碱蓬生长时，短时间内翅碱蓬可以通过自身的应激反应来抵抗逆境。若环境中Zn2+和Cu2+浓度过高，毒害时间过长，翅碱蓬生长将会受到抑制，直至死亡。本研究结果可望为更深入研究滨海湿地的重金属污染防治提供数据资料。