基于HPLC指纹图谱的无籽刺梨亲缘证据初探

陈俊磊，成 礼，胡恩明，姜阳明，黄烈军，张嘉瑜，杨小生，顾 玮*

(1.贵州医科大学 药用植物资源功效利用与开发国家重点实验室，贵州 贵阳 550014； 2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014)

无籽刺梨(Rosasterilis)又名无子刺梨、金刺梨、或塔钩刺梨，为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)多年生灌木，1985年时圣德将其作为新分类群发表，为贵州省特有品种[1]。由于无籽刺梨相比贵州传统水果刺梨——缫丝花(R.roxburghiix)的果实具有明显的优势，其果肉更加细腻，口感酸甜，并无刺梨的酸涩之味，更适合作为水果直接食用等特点，目前在贵州省安顺市和黔西南州有广泛的引种栽培与开发[2-5]。无籽刺梨发育过程不产生种子或者种子败育，只能依赖无性繁殖[6]。野生蔷薇属植物的自然杂交能力已经被很多实验以及园艺品种培育的实践证明[7]。学界认为无籽刺梨可能为一个自然杂交种，其并不能划分为一个独立的种，目前未被中国植物志收录。关于其杂交起源或者亲缘，近年来开展了一些相关研究。李旦等[8]利用AFLP分子标记和DNA条形码技术，对采自贵州省兴仁县和贵州省安顺市的刺梨、无籽刺梨和光枝无籽刺梨(R.sterilisvar.leioclada)共19份样本材料进行鉴定，结果表明无籽刺梨与刺梨是独立的2个种，兴仁县无籽刺梨与安顺市的光枝无籽刺梨为同一个种。邓亨宁等[9]分析了蔷薇属植物15种、2个变种和2个变型的5个叶绿体基因片段(psb-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1)和2个核基因片段(ITS和GAPDH)，推测无籽刺梨起源于长尖叶蔷薇(R.longicuspis)与缫丝花的天然杂交，长尖叶蔷薇为母本，缫丝花为父本。而文晓鹏等[10]基于形态学和RAPD分析，认为无籽刺梨很可能来源于贵州缫丝花(R.kweichowensis)的高度雄性不育变异，和缫丝花有明显差别，不可聚为一类。陈兴银等[11]对采自贵州兴仁的无籽刺梨、贵州安顺的光枝无籽刺梨以及采自贵州遵义、兴仁的缫丝花和从NCBI网站下载的长尖叶蔷薇进行了ITS序列分析，结果显示无籽刺梨与长尖叶蔷薇聚为一支。综合前人的研究结果来看，无籽刺梨的真正起源仍旧缺乏足够证据。

肖培根等提出的药用植物亲缘学从理论上总结药用植物的生物亲缘关系、化学成分和疗效间的相关性[12-14]。植物次生代谢产物是其发挥药用功效的主要成分，不同类群植物次生代谢产物有明显的差异性，根据植物体内次生代谢产物的异同也可以作为植物分类的标准之一。本研究基于植物化学分类学的理论，采用HPLC指纹图谱进行相似度分析和聚类分析，根据其化学图谱的特征探讨无籽刺梨的亲缘关系及分类问题，以期为其基原鉴别和质量评价提供新的方法和依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国Agilent科技有限公司)；电热恒温水浴锅(HWS24，上海一恒科学仪器有限公司)；多功能粉碎机(2500Y，永康市铂欧五金制品有限公司)；万分之一电子分析天平(ME104E，梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司)；超声清洗器(KQ5200，昆山市超声仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(TGL-16，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；旋转蒸发仪(EYELA N-1100，日本东京理化器械株式会社)。

1.2 材料与试剂

纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；甲醇色谱纯(上海星可高纯溶剂有限公司)；甲酸(天津市富宇精细化工有限公司)；95%乙醇(重庆万盛川东化工有限公司)。

无籽刺梨材料采自安顺市西秀区无籽刺梨种植基地，其余10种野生蔷薇属植物材料采集自贵阳周边以及安顺、兴义、雷山等地，标本由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室顾玮副研究员鉴定，植物拉丁学名参考《中国植物志》全文电子版[15]，植物标本(2019-Z-10)存放于贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室。具体材料来源信息如表1所示。

表1 蔷薇属植物的来源Table 1 Sources of Rosa plants

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

取药材粉末50 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入5倍剂量80%乙醇回流提取2次，每次4 h，补足失重，摇匀，过滤，合并两次滤液，回收乙醇至无醇味。浓缩液依次用乙酸乙酯、正丁醇分别萃取5次(每次75 mL)。其中乙酸乙酯萃取液经减压浓缩至干燥后，得脂溶性部位。取该部位150 mg，精密称定，加入甲醇溶解并定容至5 mL，超声处理15 min，放冷，摇匀。取供试品溶液适量，离心后取上清液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.3.2 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.02%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～45 min，13%A；45～50 min，13%～15%A；50～90 min，15%A；90～120 min，15%～25%A；120～160 min，25%A；160～170 min，25%～30%A；170～200 min，30%A；200～220 min，30%～40%A；220～250 min，40%～55%A，250～255 min，55%～70%A)；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1；进样量3 μL；检测波长268 nm。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密性试验

取无籽刺梨供试品溶液，按1.3.2项所述色谱条件重复进样6次。选取60号峰为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，分别为0.02%～0.43%和0.68%～3.39%；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件计算其相似度均为100%。结果表明仪器精密度良好。

2.1.2 稳定性试验

取无籽刺梨供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、25 h按1.3.2项所述色谱条件进样。选取60号峰为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，分别为0.03%～0.53%和0.58%～4.39%；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件计算其相似度均为100%。结果表明供试品溶液25 h内稳定。

2.1.3 重现性试验

取无籽刺梨粉末6份，精密称定，分别按照1.3.1项下方法制备供试品溶液，按1.3.2项所述色谱条件进样。选取60号峰为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，分别为0.01%～0.68%和0.55%～3.57%；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件计算其相似度均为100%。结果表明方法重现性良好。

2.2 指纹图谱的建立及分析

2.2.1 指纹图谱共有模式的建立

取S1～S11粉碎的药材，按1.3.1项制备供试品溶液，按1.3.2项色谱条件进行分析，记录各个样品的HPLC色谱图。将其原始数据导入国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，以无籽刺梨为对照谱图，对保留时间5～255 min的色谱峰进行多点校正后，自动匹配，得到11种蔷薇属植物脂溶性部位HPLC指纹图谱叠加图，如图1所示。

图1 11种蔷薇属植物脂溶性部位HPLC指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprints of liposoluble parts from 11 Rosa species

2.2.2 相似度评价

由无籽刺梨的HPLC色谱图可知，共识别出93个单峰，占其总峰面积的94%。以无籽刺梨的93个单峰为参考，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，以时间宽度为0.5 min进行峰匹配，确定11种蔷薇属植物有29个共有峰，分别为1、7、8、13、15、23、26、28、30、32～35、37、39、43、48、56、59、60、62、67、70、72、75、86、90、92及93。选取60号峰为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和RSD，如表2所示。

表2 共有峰相对保留时间Table 2 Relative retention times of common peaks

同时，通过保留时间比较发现，无籽刺梨分别与缫丝花、长尖叶蔷薇、复伞房蔷薇、悬钩子蔷薇、软条七蔷薇、拟木香、钝叶蔷薇、小果蔷薇、单瓣白木香及金樱子的共有峰数为69、75、65、62、67、66、63、63、67及59，分别为其单峰数的74.2%、80.6%、69.9%、66.7%、72%、71%、67.8%、67.8%、72%及63.4%。其中长尖叶蔷薇、缫丝花和无籽刺梨的共有峰最多，与无籽刺梨化合物数量相似度分别为80.6%和74.2%。此外，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件计算无籽刺梨和10种蔷薇属植物的相似度，如表3所示。

表3 相似度对照表Table 3 Similarity comparison

2.2.3 聚类分析

采用SPSS 25.0软件，以无籽刺梨的93个单峰，以及与10种蔷薇属植物的共有峰面积为变量(若无共有峰，则该峰面积为0)，得到11×93矩阵，先进行标准化处理后采用瓦尔德联接法，利用欧氏距离作为度量标准，Z值得分标准化进行聚类分析，结果如图2所示。由图可知，当欧氏距离为10时，可将11种蔷薇属植物脂溶性部位大致分为4类：无籽刺梨、长尖叶蔷薇及小果蔷薇聚为一类，复伞房蔷薇、悬钩子蔷薇、软条七蔷薇、拟木香、钝叶蔷薇及单瓣白木香聚为一类；缫丝花及金樱子各自为一类。

图2 聚类分析结果Fig. 2 Result of clustering analysis

3 结论与讨论

3.1 条件优化

本研究采用全波长扫描200～400 nm内的PDA扫描图谱，结果发现在268 nm下色谱信息最丰富，各色谱分离相对较好、基线平稳，信息量大，故选择268 nm作为检测波长；由于绝大多数药用植物中的有效成分属于次生代谢产物，且较为复杂，因此使用单一流动相很难达到较好的分离效果。本研究选择甲醇-0.02%甲酸水溶液体系作为流动相，采用梯度洗脱程序，同时为了尽量识别出样品的每个色谱峰，也结合了等度洗脱的程序。加入甲酸调pH是为了改善色谱峰的分离程度及峰形。此外，结合文献[16]方法并加以修改对上述条件进行方法学考察，其精密型、稳定性及重现性试验中所得RSD值均小于5%，符合HPLC指纹图谱的要求，表明该方法准确可靠，重现性较好。

3.2 综合分析方法的探讨

对于建立HPLC指纹图谱的方法，相关研究多数采用选取某一样品作为参照谱图，进行多点校正和自动匹配后生成对照指纹图谱，而后利用其共有成分进行聚类分析、主成分分析、偏最小二乘法判别等，广泛用于同种植物在不同产地、季节或批次等的品质鉴定、质量控制及亲缘关系[17-20]。然而，利用所有样品共有成分进行综合分析，这对研究无籽刺梨与蔷薇属植物间的化学亲缘关系似乎不太合理，因为选取的共有成分进行综合分析，可能会忽略无籽刺梨与同属的一个或多个植物的共有信息。因此，为了确保这些信息能有效参与分析，本研究借鉴秦华珍[21]和苏善美[22]等的研究思路并结合聚类分析加以修改，以无籽刺梨为参照谱图，其它10种蔷薇属植物与该参照谱图进行对照，构建指纹图谱叠加图，并进行相似度评价和聚类分析，探讨无籽刺梨的亲缘关系。此外，还比较了无籽刺梨分别与10种蔷薇属植物的共有峰数。

3.3 无籽刺梨化学亲缘关系的探讨

无籽刺梨不产生种子，自然繁殖困难，一般认为是一个自然杂交种，野生资源较少，近年来没有在野外见到实物，缺少遗传多样性和选育基础。目前，大面积栽培无籽刺梨主要依赖无性系繁殖，而大量多代无性繁殖可能会面临品质退化问题[23]。因此，探究无籽刺梨的亲缘关系，进一步选育近缘种进行杂交，为保存其品质提供一定的理论基础。本研究建立11种蔷薇属植物脂溶性部位的HPLC指纹图谱，采用相似度评价和聚类分析探讨无籽刺梨与10蔷薇属植物的化学亲缘关系。

指纹图谱相似度评价是国家公认的判定中药化学成分相似性的一种方法[21]。一般认为其相似度越高，化学成分就越相似。本研究首次基于化学分类学的理论探究无籽刺梨的生物学发生及亲缘关系，对收集到的11种蔷薇属植物脂溶性部位化学成分进行分析。相似度分析显示，与无籽刺梨相比，10种蔷薇属植物中有8种植物的相似度大于85%，这在一定程度上说明蔷薇属植物化学成分的保守性和稳定性较高。其中长尖叶蔷薇、缫丝花和无籽刺梨的共有峰最多，为无籽刺梨单峰数的80.6%和74.2%。聚类分析结果将11种蔷薇属植物分为4类，其中无籽刺梨与长尖叶蔷薇、小果蔷薇聚为一类，进一步说明无籽刺梨与长尖叶蔷薇的化学成分较其它相似。因此，综合两种分析结果可以看出，无籽刺梨与长尖叶蔷薇的化学成分最相似，可以推测二者在分类学上有较近的亲缘关系。该结论与邓亨宁[8]和陈兴银[11]等针对DNA条形码的分析推论基本一致。另外，从相似度分析和聚类分析结果也可以初步判断无籽刺梨与缫丝花和小果蔷薇也有较近的亲缘关系，但是否为无籽刺梨的杂交亲本之一仍旧无法判定。

不同类群和物种的植物次生代谢产物尽管具有一定的保守性，但是可能会受到季节环境等因素的影响而产生一些变化。因此，无论从化学成分角度还是某几种基因片段来推测物种亲缘关系都有一定的局限性。在后续研究中，或可以将二者有机结合，对无籽刺梨产地现有的所有蔷薇属物种进行全面的分析，可能会得出更加真实有效的结论。