金银花木樨草苷对大鼠抑郁及中枢海马神经递质调控的影响

赵 孟 王玉婷 戢汉斌∗

［1.武汉市武东医院）武汉市第二精神病医院）， 湖北 武汉430084； 2.武汉大学药学院实验中心， 湖北武汉430072］

抑郁症是一种持续的心境低落，甚至有自残、自杀等行为的精神疾病，有研究认为其与遗传、外界环境应激等相关［1］，但具体的病理机制尚不明确。临床报道显示抑郁症患者外周血中5⁃羟色胺（5⁃HT）和多巴胺（DA）等神经递质的水平是显著降低的，因此大多数学者认为中枢系统单胺递质失衡，如5⁃HT、DA、NE 下调可能是导致抑郁发生的主要原因［2⁃3］。目前，临床上抗抑郁治疗的一线药物是氟西汀，作为选择性5⁃HT 再摄取抑制剂，它能通过抑制突触间隙对5⁃HT 的再摄快速逆转中枢及外周单胺递质水平的失衡；但不足的是患者服药治疗后抑郁症状缓解相对滞后［4⁃5］，这表明不仅单胺递质参与了抑郁的生理病理过程，其他因子可能也参与其中。在长期应激刺激下，机体下丘脑⁃垂体⁃肾上腺皮质HPA 轴功能持续亢进，由于海马神经元脑源性神经营养因子（BDNF）水平下调，海马结构和功能随之发生改变［6］，这可能使抑郁进一步加剧。因此，从天然产物中寻找治疗神经精神类疾病的活性单体物质，弥补现有药物疗效的不足，探讨相关的作用机制是近年来中医药研究的热点。

金银花lonicera japonica属于忍冬科科植物，自古就被誉为清热解毒的良药。研究表明金银花醇提物中富含大量黄酮类物质，其中最主要的成分就是木樨草苷（cy⁃narosid）［7⁃8］，它可通过血脑屏障，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等生理功效。然而，金银花木樨草苷对中枢系统神经退行性精神疾病是否有改善作用，能否逆转单胺递质失衡，缓解海马结构损伤和功能障碍，治疗抑郁尚未见相关文献报道。因此，本文将探究金银花木樨草苷对大鼠抑郁行为的改善作用，并探讨其是否通过调节海马BDNF 表达及单胺递质系统发挥抗抑郁作用。

本研究通过慢性不可预知性应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）结合孤养法构建大鼠抑郁模型，采用旷场实验，悬尾实验和强迫游泳实验评估药物治疗前后大鼠行为学的改变；高效液相⁃荧光分析法测定中枢系统单胺递质5⁃HT、NE、DA 水 平，Western blot 和RT⁃PCR 测 定BDNF 蛋白及mRNA 的表达，初步探讨金银花木樨草苷抗抑郁作用机制，为后续单体活性物质的开发利用提供参考依据。

1 材料

1.1 动物 雄性SD 大鼠48 只，体质量180～200 g ［湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）2011⁃0003］，自由觅食、饮水，饲养于自然光暗周期的环境中。

1.2 试剂与药物 金银花（亳州市双宝中药材有限公司，一等品）。羧甲基纤维素钠、盐酸氟西汀片（批号2079A）购自礼来苏州制药有限公司。木樨草苷、5⁃羟色胺（5⁃HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）均购自美国Sigma 公司；BDNF 引物由美国Invitrogen 公司合成，TRIzol总RNA 提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；cDNA Kit 合成试剂盒购自罗氏公司。氟西汀、金银花木樨草苷用0.5%羧甲基纤维素钠溶液现配成混悬液。

1.3 仪器 HH⁃600 水浴锅（科华仪器有限公司）；HPLC高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ANTEC 荧光检测器（荷兰安泰克公司）。

2 方法

2.1 金银花木樨草苷的提取 将文献方法略微调整，醇提金银花木樨草苷［7⁃8］。将金银花花瓣粉碎，取50 g 溶于500 mL 70% 乙醇中浸泡24 h，75 ℃回流提取3 h，提取液旋转蒸发至无乙醇味，蒸馏水配成1 g／mL 醇提物，混合液经101 大孔树脂分离得到粗提液，收集后经HPLC 测定其含有量。分析采用Cosmosil π⁃NAP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脱（0～15 min，甲醇∶ 0.4%H3PO4＝1 ∶ 9；15～40 min，甲醇∶0.4% H3PO4＝2 ∶8；40 min 后，甲 醇 ∶ 0.4% H3PO4＝3 ∶ 7）；体积流 量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波 长350 nm；进样量20 μL。

将浓缩液干燥成膏（棕褐色，每1 g 生药含木樨草苷4.74 mg），生理盐水溶解，配成高、中、低3 个剂量，即100、50、25 mg／kg。

2.2 分组、造模及给药

2.2.1 分组 大鼠适应性饲养1 周后禁水不禁食24 h，然后给予1%蔗糖水，测定1 h 内消耗量。选择48 只摄入量相近的大鼠，随机分空白组、模型组、氟西汀组、金银花木樨草苷组（100、50、25 mg／kg），每组8 只。

2.2.2 造模 空白组大鼠采用合笼饲养，饲养环境室温（24±1）℃，相对湿度（60±10）%，正常进食饮水，不给予任何刺激，其余组采用CUMS 结合孤养法构建大鼠慢性应激抑郁模型，每笼饲养1 只，连续4 周每天下午15：00 给予2 种不同的刺激，包括昼夜颠倒（24 h）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、4 ℃冰水游 泳（5 min）、45 ℃热 烘（5 min）、潮湿饲养（潮湿垫料）［9⁃10］。于实验前后对6 组大鼠进行行为学测试，评估抑郁症状、造模是否成功。

2.2.3 给药 实验边造模边给药，每天上午10：00 灌胃1次。空白组和模型组均给予0.5% 羧甲基纤维素钠混悬液（10 mL／kg），盐酸氟西汀组给予0.5% 羧甲基纤维素钠配制的氟西汀悬浮液（2 mg／kg），金银花木樨草苷高、中、低组则分别给予0.5%羧甲基纤维素钠配制的金银花木樨草苷悬浮液（100、50、25 mg／kg），连续4 周。末次给药后进行行为学测试，评估完成后进行各个指标的检测。

2.3 行为学评估 于实验前和实验开始第28 天灌胃给药后1 h，进行旷场实验、悬尾实验和强迫游泳实验，评估各组大鼠行为状态。

2.3.1 旷场实验 参照文献［9⁃10］，将各组大鼠放入5×5 的25 格纸箱中（100 cm×100 cm），记录5 min 内运动情况（直立次数、水平穿过格数），直立次数以双前爪同时抬起为准，以3 只以上爪同时在1 个格子为穿越1 个水平格子。

2.3.2 悬尾实验 参考文献［9⁃10］，用胶带黏住大鼠尾端2 cm 的部位，悬挂在距离桌面50 cm 的架子上，头朝下，前后左右均无攀抓物，一段时间后大鼠活动减少，观察6 min 的活动情况，大鼠静止垂直倒悬的时间为悬尾不动时间，其中前1 min 不作记录，记录后5 mim 内时间。

2.3.3 强迫游泳实验 参考文献［9⁃10］，将大鼠置于一个透明容器内（高度为60 cm，直径为25 cm），保持水位为30 cm，水温为（25±2）℃。观察大鼠6 min 的行为状况，记录后5 min 内游泳不动时间（大鼠在水上漂浮没有四肢的挣扎，偶尔移动仅是保持头部露在水面以上）。

2.4 高效液相⁃荧光法（HPLC⁃F）测定大鼠海马单胺递质水平 于实验第28 天完成行为学实验后，断头处死各组大鼠，迅速在冰上剥离大脑，取出海马组织，称量后置组织冷冻管中，液氮快速冷冻备用。称取一定量的海马组织，加入适量预冷的0.1 mol／L 过氯酸（含0.3 mmol／L EDTA二钠和0.5 mmol／L 亚硫酸钠），冰水浴中超声匀浆，4 ℃避光静置一段时间后10 000 r／mim 离心10 min，取上清液过滤后，HPLC⁃F 测定单胺递质水平，取20 μL 过滤液自动进样测定。条件为Diammonsilim C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相100 mmol／L 枸橼酸⁃柠檬酸钠缓冲液（pH ＝4.0），0.1 mmol／L EDTA，16% 甲醇；体积流量0.8 mL／min；荧光检测器激发波长254 nm，发射波长340 nm，单胺递质水平单位以ng／g 表示。

2.5 RT⁃PCR 检测 称取各组大鼠海马50 mg，采用TRIzol法提取总RNA，然后将1 μg 总RNA 通过cDNA Kit 试剂盒进行反转录。荧光定量PCR 在LightCycler＠480（Roche 公司）设备中进行，每个样品设置3 个重复，并以GAPDH作为内参，定量PCR 特异产物通过溶解曲线分析，以2-ΔΔct表示相对基因表达变化，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件对数据进行方差齐性检验，计量数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 金银花木樨草苷含有量测定 根据文献方法提取分离金银花木樨草苷，并采用HPLC 进行含有量测定［7⁃8］，根据对照品质量浓度（X，mg／mL）和峰面积（Y）进行线性回归，得方程为Y＝323.86X-61.62（r＝0.999）。由图1A 可知，木樨草苷色谱峰保留时间为25 min，1 g／mL 金银花醇提物经大孔树脂分离后，其质量浓度为4.74 mg／mL。

图1 各成分HPLC 色谱图

3.2 金银花木樨草苷对抑郁大鼠行为学的影响 如表2 所示，实验前各组大鼠水平和垂直自主活动量相近，差异无统计学意义（P＞0.05）；4 周后，模型组大鼠水平穿越格数和直立次数较空白组降低（P＜0.05）；给予氟西汀和金银花木樨草苷干预后，大鼠水平穿格数和直立次数与模型组比较增加（P＜0.05），且金银花木樨草苷对抑郁大鼠自主活动的改善作用随着给药剂量升高而增加，其疗效接近阳性药氟西汀。

表2 各组大鼠水平方向运动格数和直立次数（， n＝8）

表2 各组大鼠水平方向运动格数和直立次数（， n＝8）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。

由表3 可知，实验前各组大鼠悬尾和游泳不动时间非常接近，差异无统计学意义（P＞0.05）；经过4 周慢性应激刺激造模后，模型组大鼠悬尾和游泳不动时间延长（P＜0.05）；给予氟西汀和金银花木樨草苷后，悬尾和游泳不动时间减少（P＜0.05），不动时间缩短了30～50 s，大鼠抑郁不动状态得到逆转，且高剂量组效果更优，呈现剂量依赖性。

3.3 金银花木犀草苷对大鼠海马区单胺递质水平的影响 图2A 为神经递质NE、DA、5⁃HT 标准品的色谱图，峰保留时间分别为4.85、5.35、7.25 min，分离度良好。空白组海马组织色谱图如图2B 所示，分别在5.0、5.5、7.5 min检测到NE、DA、5⁃HT。各组大鼠海马组织神经递质含有量测定结果见图2C，与空白组比较模型组大鼠海马内单胺类神经递质5⁃HT、NE、DA 水平降低（P＜0.05）；药物干预后，各组大鼠海马组织单胺类神经递质水平与模型组相比有大幅回升（P＜0.05），其中氟西汀组更明显，金银花木樨草苷高剂量组次之，疗效与给药剂量有关。

3.4 金银花木犀草苷对大鼠海马区BDNF 蛋白和mRNA 表达的影响 如图3 所示，与空白组相比，模型组海马区BDNF 蛋白和mRNA 表达下调（P＜0.05）；氟西汀和金银花木樨草苷能改善大鼠抑郁行为，还能使海马区BDNF 蛋白、mRNA 表达上调，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

4 讨论

近年来，中医药发展迅速，从天然产物中提取有效活性单体治疗相关疾病成为中医药领域的研究热点。本文探究了金银花木犀草苷对抑郁大鼠行为状态的影响，结果证实了其良好的抗抑郁作用。大鼠经过4 周慢性不可预知性应激后，自主活动量较空白组明显减少，悬尾及游泳不动时间显著增加。这一结果和邓海峰等人的研究一致［10］，在不良应激源刺激下，大鼠自主活动减少，兴趣丧失，长期处于呆滞状态，绝望无助的表现与临床抑郁症患者精神运动性抑制、兴趣缺失等症状相同。给予金银花木樨草苷和氟西汀治疗后，大鼠在旷场试验中自主活动明显增加，悬尾及游泳不动时间缩短，证明了金银花木樨草苷能改善动物的抑郁行为，具有一定的抗抑郁作用。

表3 各组大鼠悬尾不动时间和游泳不动时间（， n＝8）

表3 各组大鼠悬尾不动时间和游泳不动时间（， n＝8）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05。

图2 金银花木犀草苷对大鼠海马区单胺递质水平的影响

图3 金银花木犀草苷对大鼠海马区BDNF 表达的影响

抑郁症的发病机制假说众多，其中单胺递质假说和神经营养假说得到广泛认可。单胺递质假说提出抑郁症的生物学基础是中枢系统单胺递质5⁃HT、NE、DA 的缺乏。大脑5⁃HT 系统、NE 系统和DA 系统参与了睡眠和情绪等生理活动的调控过程，而神经递质的改变将直接或间接影响相关受体功能，5⁃HT 等水平低下的人群易产生抑郁情绪或行为［11］。本研究结果显示，模型组大鼠海马组织中的神经递质5⁃HT、NE、DA 水平显著下调，这和王含彦等人的报道相符［12］，在慢性应激刺激下，大鼠中枢系统单胺递质水平减少，相关受体功能紊乱，进而产生抑郁样行为。海马区是应激反应的高位调节中枢，对情绪、学习和记忆的调控有着重要生理作用，临床报道显示抑郁症患者海马部位的结构和功能均发生了明显改变［13］。神经营养假说认为［14⁃16］，海马结构和功能的改变是由于海马区神经元细胞的凋亡，BDNF 具有神经保护和抗凋亡作用，其水平升高有助于抑制海马神经元的凋亡。研究表明［17⁃18］，单胺递质系统与BDNF 的表达密切相关，5⁃HT 等递质可以调节其表达，反之BDNF 也可以保护5⁃HT 等神经元，促进突触生长，增加突触间隙神经递质的含量。和空白组比较，模型组大鼠海马区DBNF 蛋白和mRNA 表达显著降低。金银花木犀草苷可逆转应激刺激导致的海马单胺递质水平的下降，给药组大鼠海马区5⁃HT、NE 和DA 水平显著升高，同时BDNF 蛋白及mRNA 表达也明显增加，说明金银花木犀草苷可能是通过上调海马区BDNF 表达量，逆转海马结构和功能的改变，减少神经元细胞的凋亡，从而调节中枢系统的单胺神经递质发挥抗抑郁疗效，且高剂量组抗抑郁效果优于低剂量组。

综上所述，金银花木樨草苷可逆转并改善慢性应激引起的抑郁样行为，其可能的机制是上调海马BDNF 表达，增加中枢单胺类神经递质水平。