光皮木瓜化学成分研究及其神经保护活性

李 孟 张志广 王梦梦石静亚张靖柯吕锦锦常 远郑晓珂冯卫生∗

（1.河南中医药大学， 河南 郑州450046； 2.河南省中药开发工程技术研究中心， 河南 郑州450046；3.中央民族大学药学院， 北京100081）

光皮木瓜Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne为蔷薇科木瓜属植物木瓜的成熟果实，又名榠楂、土木瓜。其果实形状为长椭圆形或椭圆形，外皮光滑，果肉味酸、涩，性平，归胃、肝、肺经，具有利胃舒筋、祛风湿、消痰止咳的功效［1⁃3］，广泛分布于陕西、山东、河南、湖北、安徽等省。木瓜果实营养丰富，被誉为“百益果王”，是集加工食用、药用和观赏于一体的、极具开发价值的新型经济树种之一［4］。河南南阳地区种植有大面积的光皮木瓜，但对其化学成分研究较少，课题组前期从中分离得到3 个生物碱类化合物［5］，本实验采用多种色谱技术又分得9 个萜类化合物，均为首次从该植物中发现，并采用MTT 法检测各化合物对皮质酮诱导的大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC⁃12 细胞）损伤的保护作用，结果表明，化合物3～5、7 对PC⁃12细胞具有显著活性。

1 材料

Bruker AVANCE Ⅲ500 核磁共振仪（TMS 为内标）、Bruker maxis HD 型飞行时间质谱仪（德国Bruker 公司）；Nicolet iS 10 Microscope Spectrometer红外光谱仪（美国Thermo fisher 公司）；Shimadzu UV⁃2401PC apparatus 紫外光谱仪（日本岛津公司）；Chirascan qCD（英国应用光物理公司）；LC50 型高压制备液相色谱仪［赛谱锐思（北京）科技有限公司］；iMark 酶标仪（美国Bio⁃Rad 公司）；ECLIPSE TS100 倒置显微镜（日本Nikon 公司）；SW⁃CJ⁃2FD 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Forma 3111 细胞培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；Centrifuge⁃5804R 小型高速低温冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；微量加样器（法国Gilson 公司）；多功能暗箱紫外透色仪（ZF⁃90）、优普超纯水机、红外光谱仪、冷冻干燥机（EYELA PDU⁃2110）、鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；A⁃1000S 水流抽气机（东京理化器械株式会社）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）。柱层析填充剂所用Diaion HP⁃20、MCI Gel CHP⁃20、Toyopearl HW⁃40（日本三菱化学公司）；Sephadex LH⁃20（瑞士Parmacia Biotech 公司）；柱层析所用硅胶H（160～200 目，青岛海洋化工厂）。所用分析纯和色谱纯试剂（北京化工厂和天津第三化学试剂厂）；DMEM 培养基、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；青霉素、硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；MTT、DMSO、hepes（美国Amresco 公司）。

光皮木瓜采自河南省方城县，经河南中医药大学药学院陈随清教授及董诚明教授鉴定为蔷薇科木瓜属植物光皮木瓜Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne 的成熟果实。

2 提取与分离

取鲜品30 kg，去籽切成1.5 cm3，用50%丙酮组织破碎提取。提取液减压浓缩、冷冻干燥，得50%丙酮提取总浸膏（2.67 kg），80% 乙醇醇沉、滤过，上清液离心液减压浓缩至无醇味的浸膏状，上Diaion HP⁃20 大孔吸附树脂柱，乙醇⁃水（0 ∶100、10 ∶90、20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、70 ∶30、95 ∶5）梯度洗脱，合并各部位得到8 个馏分（Fr.1～8）。Fr.3（39.3 g）经Toyopearl HW⁃40C 柱色谱，甲醇⁃水（0 ∶100、10 ∶90、20 ∶80）梯度洗脱，合并相同馏分，得到Fr.3.1～3.5，Fr.3.1 经Sephadex LH⁃20 和半制备液相，得到化合物2（10.8 mg）、3（5.4 mg）、4（7.6 mg）、5（11.2 mg）；Fr.3.4 经ODS、Sephadex LH⁃20 柱色谱和半制备液相，得到化合物6（4.3 mg）、7（6.1 mg）。Fr.3.2 经ODS⁃18 反相色谱柱，甲醇⁃水（10 ∶90、20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60）梯度洗脱，合并相同馏分，再经Sephadex LH⁃20 柱色谱和半制备液相，得到化合物1（3.2 mg）、8（4.3 mg）、9（4.8 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色固体（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI⁃MSm／z：441.2 ［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.31（1H，dd，J＝0.7，11.5 Hz，H⁃3），6.48（1H，dd，J＝11.5，15.0 Hz，H⁃4），6.17（1H，ddd，J＝7.3，7.9，15.0 Hz，H⁃5），5.53（1H，d，J＝ 8.0 Hz，H⁃1′），3.68（3H，s，H⁃13），2.57（1H，dd，J＝3.4，15.1 Hz，H⁃9b），2.40（1H，m，H⁃6b），2.35（1H，dd，J＝9.5，15.1 Hz，H⁃9a），2.09（1H，m，H⁃6a），1.93（3H，s，H⁃11），0.90（3H，s，H⁃12）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.4（C⁃10），168.7（C⁃1），143.9（C⁃2），141.4（C⁃3），128.7（C⁃4），125.4（C⁃2），95.9（C⁃1′），78.8（C⁃5′），78.1（C⁃3′），74.0（C⁃2′），72.9（C⁃8），71.1（C⁃4′），62.3（C⁃6′），52.1（C⁃13），15.8（C⁃12），12.5（C⁃11）。以上数据与文献［6］基本一致，故鉴定为8⁃hydroxy⁃2，7⁃dime⁃thyl⁃2E，4E⁃decadienedioic acid 1⁃β⁃D⁃glucopyranyl ester 10⁃methyl ester。

化合物2：黄色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI⁃MSm／z：279.1 ［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.17（1H，d，J＝10.8 Hz，H⁃3），6.45（1H，dd，J＝10.8，15.0 Hz，H⁃4），6.08（1H，dt，J＝15.0，7.8 Hz，H⁃5），3.86（1H，m，H⁃8），3.66（3H，s，⁃OCH3），2.50（1H，dd，J＝4.2，15.0 Hz，H⁃9a），2.44（1H，m，H⁃6a），2.33（1H，dd，J＝9.0，15.0 Hz，H⁃9b），2.09（1H，dt，J＝13.8，7.8 Hz，H⁃6b），1.89（3H，s，H⁃11），1.69（1H，m，H⁃7），0.92（3H，d，J＝6.6 Hz，H⁃12）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.4（C⁃10），172.1（C⁃1），142.5（C⁃5），140.1（C⁃3），128.8（C⁃4），126.3（C⁃2），72.9（C⁃8），52.1（⁃OCH3），40.3（C⁃9），40.0（C⁃7），37.1（C⁃6），12.8（C⁃12），12.6（C⁃11）。以上数据与文献［7］基本一致，故鉴定为monomethyl glansreginate。

化合物3：淡黄色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI⁃MSm／z：427.2 ［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.18（1H，d，J＝11.3 Hz，H⁃3），6.47（1H，dd，J＝11.3，15.0 Hz，H⁃4），6.09（1H，dt，J＝15.0，7.8 Hz，H⁃5），4.33（1H，d，J＝ 7.8 Hz，H⁃1′），4.02（1H，m，H⁃8），3.96（1H，m，H⁃6′a），3.82（1H，m，H⁃6′b），3.36～3.45（4H，m，H⁃2′，H⁃3′，H⁃4′，H⁃5′），2.64（1H，m，H⁃9），2.47（1H，m，H⁃6），1.96（1H，m，H⁃7），1.89（3H，s，H⁃12），0.95（3H，s，H⁃11）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：176.3（C⁃10），172.1（C⁃1），142.6（C⁃5），140.2（C⁃3），128.9（C⁃4），126.3（C⁃2），104.7（C⁃1′），81.8（C⁃8），78.1（C⁃5′），77.7（C⁃3′），75.3（C⁃2′），71.5（C⁃4′），62.7（C⁃6′），39.0（C⁃9），38.6（C⁃7），36.9（C⁃6），15.5（C⁃12），12.7（C⁃11）。以上数据与文献 ［8］基本一致，故鉴定为2，7⁃dimethyl⁃2，4⁃diene⁃deca⁃α，ω⁃diacid。

化合物4：棕色粉末（甲醇），ESI⁃MSm／z：207.1 ［M＋Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.76（1H，dd，J＝7.6，6.5 Hz，H⁃3），5.91（1H，dd，J＝17.4，10.8 Hz，H⁃7），5.22（1H，dd，J＝17.4，1.5 Hz，H⁃8a），5.05（1H，dd，J＝17.4，1.5 Hz，H⁃8b），2.23（2H，m，H⁃4），1.79（3H，s，H⁃10），1.59（2H，m，H⁃5），1.27（3H，s，H⁃9）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：170.5（C⁃1），145.9（C⁃7），143.9（C⁃3），128.8（C⁃2），112.4（C⁃8），73.6（C⁃6），41.8（C⁃5），24.5（C⁃4），27.8（C⁃9），12.3（C⁃10）。以上数据与文献［9］基本一致，故鉴定为（6S）⁃menthiafolic acid。

化合物5：黄色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI⁃MSm／z：207.1 ［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.18（d，J＝11.4 Hz，H⁃6），6.47（1H，dd，J＝11.4，15.0 Hz，H⁃5），6.09（1H，dt，J＝15.0，7.5 Hz，H⁃4），3.40（2H，m，H⁃8），2.35（2H，m，H⁃2），2.03（1H，m，H⁃3a），1.89（3H，s，H⁃10），1.72（1H，m，H⁃3b），0.91（3H，s，H⁃9）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：172.1（C⁃1），142.4（C⁃5），140.1（C⁃6），128.7（C⁃4），126.3（C⁃7），67.7（C⁃8），38.0（C⁃3），37.1（C⁃2），16.8（C⁃10），12.6（C⁃9）。以上数据与文献［10］基本一 致，故鉴定 为（4E，6E）⁃2，7⁃dimethyl⁃8⁃hydroxyoctadienoic acid。

化合物6：黄色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI⁃MSm／z：265.1 ［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.17（1H，d，J＝10.8 Hz，H⁃3），6.45（1H，dd，J＝10.8，15.0 Hz，H⁃4），6.08（1H，dt，J＝15.0，7.8 Hz，H⁃5），3.86（1H，m，H⁃8），2.50（1H，dd，J＝4.2，15.0 Hz，H⁃9a），2.44（1H，m，H⁃6a），2.33（1H，dd，J＝9.0，15.0 Hz，H⁃9b），2.09（1H，dt，J＝13.8，7.8 Hz，H⁃6b），1.89（3H，s，H⁃11），1.69（1H，m，H⁃7），0.92（3H，d，J＝6.6 Hz，H⁃12）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.4（C⁃10），172.1（C⁃1），142.5（C⁃5），140.1（C⁃3），128.8（C⁃4），126.3（C⁃2），72.9（C⁃8），40.3（C⁃9），40.0（C⁃7），37.1（C⁃6），12.8（C⁃12），12.6（C⁃11）。以上数据与文献［11］基本一致，故鉴定为glansreginic acid。

化合物7：黄色油状物（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI⁃MSm／z：221.1 ［M ＋ Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.14（1H，d，J＝11.3 Hz，H⁃3），6.46（1H，t，J＝14.7 Hz，H⁃4），6.05（1H，m，H⁃5），2.55（1H，m，H⁃7），2.50（1H，m，H⁃6a），2.31（1H，m，H⁃6b），1.89（3H，s，H⁃9），1.60（3H，s，H⁃10）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：179.6（C⁃1），172.0（C⁃8），140.6（C⁃5），139.7（C⁃3），129.1（C⁃4），127.1（C⁃2），40.5（C⁃7），38.1（C⁃6），17.2（C⁃9），12.6（C⁃10）。以上数据与文献［6］基本一致，故鉴定为2，7⁃dimethyl⁃2E，4E⁃octadienedioic acid。

化合物8：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇、乙 醇。ESI⁃MSm／z：395.2 ［M ＋Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.35（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃1′），3.95（1H，dd，J＝11.7，5.4 Hz，H⁃6a′），3.85（1H，m，H⁃9），3.65（1H，dd，J＝11.7，5.4 Hz，H⁃6b′），2.52（1H，m，H⁃7a），2.45（2H，t，J＝6.7 Hz，H⁃3），2.29（1H，m，H⁃7b），1.80（2H，t，J＝6.7 Hz，H⁃2），1.74（3H，s，H⁃11），1.64（2H，m，H⁃8），1.21（3H，d，J＝6.2 Hz，H⁃10），1.18（6H，s，H⁃12，13）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：201.6（C⁃4），168.8（C⁃6），141.6（C⁃5），102.3（C⁃1′），78.2（C⁃5′），77.9（C⁃3′），75.7（C⁃9），75.2（C⁃2′），71.8（C⁃4′），62.9（C⁃6′），38.4（C⁃8），37.3（C⁃2），35.1（C⁃3），27.9（C⁃7），27.2（C⁃12），27.1（C⁃13），19.8（C⁃10），11.7（C⁃11）。以上数据与文献［12］基本一致，故鉴定为9ξ⁃O⁃β⁃D⁃glucopyr⁃anosyloxy⁃5⁃megastigmen⁃4⁃one。

化合物9：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇、乙 醇。ESI⁃MSm／z：395.2 ［M ＋Na］＋。1H⁃NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.32（1H，d，J＝7.8 Hz，H⁃1′），3.85（1H，dd，J＝11.8，2.3 Hz，H⁃2），3.66（1H，dd，J＝10.6，5.1 Hz，H⁃6a′），3.57（1H，dd，J＝10.6，5.1 Hz，H⁃6b′），2.52（2H，m，H⁃8），2.25（2H，m，H⁃7），2.12（3H，s，H⁃10），1.99（1H，m，H⁃4a），1.91（1H，m，H⁃3a），1.82（1H，m，H⁃4b），1.66（1H，m，H⁃3b），1.60（3H，s，H⁃11），1.08（3H，s，H⁃12），0.99（3H，s，H⁃13）；13C⁃NMR（CD3OD，125 MHz）δ：211.7（C⁃9），136.5（C⁃6），128.2（C⁃5），101.8（C⁃1′），82.8（C⁃2），78.3（C⁃3′），77.8（C⁃5′），75.1（C⁃2′），71.9（C⁃4′），63.0（C⁃6′），45.1（C⁃8），40.6（C⁃1），31.2（C⁃12），29.7（C⁃10），26.6（C⁃13），23.8（C⁃3），23.4（C⁃4），22.6（C⁃7），19.6（C⁃12）。以上数据与文献［13］基本一致，故鉴定为icariside B9。

4 对皮质酮诱导的PC⁃12 细胞损伤的保护作用

4.1 细胞培养 参考文献［14］方法，PC⁃12 细胞加入含10% 胎牛血清的1640 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期者进行实验。

4.2 MTT 法检测细胞活性 取对数生长期的PC⁃12 细胞，以4×104／mL 浓度接种于96 孔细胞培养板内，每孔200 μL，待细胞完全贴壁后分为正常组、模型组（CORT 造模）、化合物1～9 给药组，弃去原培养基后加入相同浓度的含药完全培养基继续培养。36 h 后，每孔加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，37 ℃下培养4 h 后吸出培养液，每孔加入150 μLDMSO，振荡10 min，酶标仪于490 nm 波长处测定吸光度（A），以正常细胞（未处理）吸光度所对应的细胞存活率为100%，计算各化合物细胞存活率，每组重复3 次，结果见表1。

表1 化合物1～9 对PC⁃12 细胞活性的影响（， n＝4）Tab.1 Effects of compounds 1-9 on the viability of PC⁃12 cells（， n＝4）

表1 化合物1～9 对PC⁃12 细胞活性的影响（， n＝4）Tab.1 Effects of compounds 1-9 on the viability of PC⁃12 cells（， n＝4）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

4.3 活性实验 与模型组比较，在浓度为5 μmol／L时，化合物3～5、7 可显著提高皮质酮诱导PC⁃12 细胞损伤的活力，表明它们可能具有潜在的神经保护活性。

5 讨论

光皮木瓜的记载始于《本草经集注》，其果实味酸、涩，性平，具有和胃舒筋、祛风湿、消痰止渴的功效，具有抗肿瘤、保肝、免疫调节、抗菌、降血糖、抗老年痴呆、抗病毒、抗氧化等多种生物活性［15⁃18］。本研究从中分离鉴定了9 个萜类化合物，均为首次从该植物中获得，并对其进行了PC⁃12 细胞损伤的保护作用研究，在一定程度上丰富了对光皮木瓜化学成分及生物活性的认识，可为其有效物质的筛选和分析提供依据。