人字果质量标准的研究

赵 超 徐文芬 孙庆文 柏彩红

（贵州中医药大学， 贵州 贵阳550025）

人字果又名岩节连，为毛茛科人字果属植物蕨叶人字果Dichocarpum dalzielii（Drumm.et Hutch.）W.T.Wang et Hsiao 的干燥全草或根茎，为贵州民间常用药材，具有清热解毒、消肿止痛的功效［1］，主要分布于贵州、四川、江西、广西等地［2⁃5］。2015 年，贵州食品药品监督管理局修订2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，将人字果列为新增补药材品种。

目前，关于人字果的研究较少，仅涉及分类学方面［6⁃13］。课题组前期采用LC⁃MS、对照品及文献比对［14⁃16］等方法，明确了人字果中含有木兰花碱，它具有抗炎、抗抑郁、抗菌等活性，而且对骨关节软骨变形有一定抑制作用［17⁃20］，这与该药材消肿止痛功效密切相关，但质量控制手段的缺乏严重制约了其良性发展。因此，本实验通过HPLC⁃DAD、酸性染料比色法分别首次测定人字果中木兰花碱、总生物碱含有量，并按照2015 年版《中国药典》四部通则方法测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，以期为有效控制该药材质量提供依据，也为其后续开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 UltiMate⁃3000 型高效液相色谱仪，配置DAD 检测器（美国Thermo 公司）；UV1800 型紫外⁃可见分光光度计（日本岛津公司）；AG135 型电子天平（瑞士Mettler⁃Toledo 公司）；KQ⁃500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Pntulips BP⁃C18色谱柱（上海谱宁分析技术有限公司）。

1.2 试剂与药物 木兰花碱对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST⁃17071711，纯度99.02%）。乙腈为色谱纯（美国天地公司）；磷酸、三乙胺、二水合磷酸二氢钠、溴百里香酚蓝、二氯甲烷、甲醇、乙醇均为分析纯；水为重蒸馏水。

1.3 药材 人字果均为课题组从贵州主要分布地区采集的野生品，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为毛茛科植物蕨叶人字果Dichocarpum.dalzielii（Drumm.et Hutch.）W.T.Wang et Hsiao 的干燥全草，具体信息见表1。药材在40 ℃下烘干，粉碎后过3 号筛，置于干燥器中备用。

2 方法与结果

2.1 常规物质检查与浸出物含有量测定 分别按照2015 年版《中国药典》 四部通则0832 水分测定法第二法、2302 灰分测定法、2201 浸出物测定法（热浸法）测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，结果见表2。

2.2 木兰花碱含有量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的木兰花碱对照品25.02 mg，置于25 mL 量瓶中，75%甲醇定容至刻度，摇匀，即得（1 000.8 mg／L）。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

表2 浸出物、水分、总灰分、酸不溶性灰分含有量测定结果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of extract，water，total ash and acid⁃insoluble ash（n＝3）

2.2.2 供试品溶液制备 取药材粉末约1.0 g，精密称定，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入75% 甲 醇25 mL，称定质 量，超 声（100 W、40 Hz）提取1 h，取出，放冷，75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取15 mL 续滤液，25 mL 石油醚（30～60 ℃）萃取3～4 次至石油醚层无明显变化，下层萃取液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 色谱条 件 Pntulips BP⁃C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃（0.1%磷酸⁃0.1%三乙胺）（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～20%A；10～30 min，20%～40% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。

2.2.4 专属性考察 精密吸取对照品、供试品溶液、空白溶液各10 μL，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分色谱峰的保留时间与对照品一致，分离度均大于1.5，而且达到基线分离，峰纯度在98%以上，表明该方法专属性良好。

图1 木兰花碱HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of magnoflorine

2.2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL 量瓶中，75%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝21.796X-0.644 1（r＝0.999 9），在0.200 2～10.01 μg 范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液10 μL，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得木兰花碱峰面积RSD 为0.47%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取药材粉末（5S）约1.0 g，精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定，测得木兰花碱含有量RSD为0.60%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 取药材粉末（5S）6 份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定，测得木兰花碱含有量RSD 为1.1%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 称取木兰花碱含有量已知的药材粉末（5S）9 份，每份约0.5 g，精密称定，分别按1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 比例加入对照品溶液，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 木兰花碱加样回收率试验结果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for magnoflorine（n＝9）

2.2.10 样品含有量测定 取12 批药材粉末，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。

表4 木兰花碱含有量测定结果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of magnoflorine（n＝3）

2.3 总生物碱含有量测定

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的木兰花碱对照品5.06 mg，置于50 mL 量瓶中，加水稀释定容至刻度，摇匀，即得（101.2 mg／L）。

2.3.2 供试品溶液制备 取“2.2.2” 项下层萃取液8 mL，稀释定容至50 mL量瓶中，即得。

2.3.3 缓冲液制备 取0.2 mol／L 磷酸二氢钠溶液适量，配制成pH 为4.5 的溶液，即得。

2.3.4 显色剂制备 取溴百里香酚蓝0.15 g，2.5 mL NaOH 溶液（1 mol／L）溶解，加水稀释定容至500 mL，即得。

2.3.5 检测波长筛选 精密吸取对照品溶液2 mL、供试品溶液（6S）1 mL，置于分液漏斗中，加入12 mL 缓冲液，摇匀，再加入2 mL 显色剂，摇匀，再加入15 mL 二氯甲烷，充分振摇2 min，静置1 h 后分取二氯甲烷液；另取12 mL 缓冲液，同法制备空白溶液。按照2015 年版《中国药典》要求，在300～600 nm 波长处进行扫描，发现对照品、供试品溶液中生物碱与染料所形成的络合物在409 nm 处均有稳定的最大吸收，故选择其作为检测波长。

2.3.6 线性关系考察 精密吸取“2.3.1” 项下对照品溶液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mL，加水稀释定容至3 mL，按“2.3.5” 项下方法测定吸光度，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝36.094X-0.056 3（r＝0.999 8），在4.048～20.24 mg／L 范围内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 取“2.3.1” 项下对照品溶液2 mL，按“2.3.5” 项下方法测定吸光度6 次，测得其RSD 为0.65%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取药材粉末（5S）约1.0 g，精密称定，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，精密量 取1 mL，于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 h 按“2.3.5” 项下方法测定吸光度，测得总生物碱含有量RSD 值为2.2%，表明溶液在5.0 h 内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 取药材粉末（5S）6 份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，按“2.3.5” 项下方法测定吸光度，测得总生物碱含有量RSD 为1.1%，表明该方法重复性较好。

2.3.10 加样回收率试验 取总生物碱含有量已知的药材粉末（5S）9 份，每份约0.5 g，精密称定，按1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 比例加入对照品溶液，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，精密量取1 mL，按“2.3.5” 项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表5。

2.3.11 样品含有量测定 取12 批药材粉末，按“2.3.2” 项下方法制备供试品溶液，精密量取1 mL，按“2.3.5” 项下方法测定吸光度，计算含有量，结果见表6。

3 讨论

3.1 木兰花碱含有量测定中色谱条件、提取方法筛选 本实验比较了甲醇⁃水、甲醇⁃酸水、乙腈⁃酸水、乙腈⁃（0.1%磷酸⁃0.1%三乙胺）的洗脱分离情况，最终选择乙腈⁃（0.1%磷酸⁃0.1%三乙胺）；比较了Thermo Accucore C18（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）、依利特Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent StableBond Analytical（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Pntulips BP⁃C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱的分离情况，发现以Pntulips BP⁃C18色谱柱检测时木兰花碱色谱峰峰形、分离度良好；再比较了不同柱温、进样量对色谱峰峰形、分离度的影响。最终，确定为“2.2.3” 项下色谱条件。

表5 总生物碱加样回收率实验结果（n＝9）Tab.5 Results of recovery tests for total alkaloids（n＝9）

表6 总生物碱含有量测定结果（n＝3）Tab.6 Results of content determination of total alkaloids（n＝3）

然后，比较了30%、50%、75%、90%甲醇作为提取溶剂时木兰花碱的提取率，最终选择75%甲醇；比较了超声、回流提取时的提取率，发现两者无明显差异，最终选择操作简便的前者；再比较了提取时间、料液比对木兰花碱提取率的影响。最终，确定为“2.2.2” 项下提取方法。

3.2 总生物碱含有量测定中提取方法、显色条件筛选 本实验比较了75%盐酸甲醇、75%甲醇作为提取溶剂时总生物碱的提取率，发现两者无明显差异，最终选择制备方便的后者；比较了不同pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）及用量（8、10、12、14、16 mL）缓冲液下络合物的吸光度，发现pH 值4.5、用量12 mL 时最大。总生物碱能否反应与酸性染料用量的关系密切，故本实验又比较了不同用量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）酸性染料下络合物的吸光度，发现用量2 mL 时最大。

最后，比较了二氯甲烷、三氯甲烷作为萃取溶剂时对总生物碱的萃取效果，发现两者无明显差异，最终选择毒性较小的前者。同时，比较了不同用量（8、10、12、15、20、25 mL）二氯甲烷下络合物的吸光度，发现用量15 mL 时最大，并且用量越低，越难以达到分配平衡，结果越不稳定，只有当其达到一定数值后继续升高，才易于达到分配平衡，萃取结果也更稳定。前期发现，萃取1、2 次时的效果无明显差异，故选择1 次。另外，在萃取过程中需不断振荡分液漏斗以保证水层与二氯甲烷层充分接触，从而达到充分萃取的目的，并且振荡后要给予足够时间使其分层，才可达到分配平衡。

4 结论

本实验首次建立了人字果中木兰花碱、总生物碱含有量的测定方法，其重复性好，稳定可靠，同时测定其中水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，可为该药材质量标准的制定及资源的开发利用提供依据。