针刺对CIRI 大鼠缺血侧海马区miRNA 表达及miR-20a-5p 和miR-22-5p 的影响

郑慧娥，何灏龙，陈芯仪，田浩梅，陈楚淘*

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙410208）

脑血管病又称脑中风、脑卒中等，已成为全球主要致残致死原因之一，主要分为出血性脑血管病和缺血性脑血管病，其中缺血性脑血管病的发病率可高达80%左右[1]。 临床上应对缺血性脑血管病的常用手段即在时间窗内及时溶栓以期恢复缺血区域的血流再灌注，控制梗死范围[2]。 而血流的再灌注如同一把双刃剑，在控制梗死范围持续扩大的同时，也势必引起一系列病理级联反应，恶化缺血半影区，造成脑组织水肿、神经元损伤等[3]，此即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）。 因此，探究控制CIRI 的治疗方法及治疗靶点对提高缺血性脑卒中的救治将有重大意义。研究发现，miRNA可调控CIRI 的相关机制，如神经发生、炎症反应、氧化应激、脑水肿形成及细胞凋亡等[4]，可见miRNA对CIRI 病理进程影响重大。 近年来，针刺调控CIRI伤方面卓有成效，但主要是围绕干预神经血管再生、氧化应激损伤、细胞凋亡、细胞自噬及炎性因子等方面展开研究[5-7]，而从基因层面整体综合探讨针刺抗CIRI 机制鲜见报道。

故本研究拟以miRNA 为视角，观察针刺对CIRI大鼠神经功能、脑梗死面积比及脑组织海马区miRNA 的影响，探究针刺促CIRI 修复的作用机制，以期丰富针刺调控CIRI 机制，为中医针灸临床、教学等提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量250～280 g。于湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买，合格证号：SCXK(湘)2013-0004。饲养于湖南中医药大学实验动物中心，饲养条件：室温22～25 ℃，湿度60%左右，12 h∶12 h 的昼夜交替周期。予自由进食进水适应性饲养7 d 后，参照随机数字表随机分为正常组、假手术组（Sham 组）、CIRI 组、CIRI+针刺组，共4组，每组15 只。

1.2 主要试剂和仪器

华佗牌0.30 mm×25 mm 无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）；线栓（北京西浓科技有限公司）、水合氯醛（天津科密欧化学试剂公司）；青霉素（江西科达动物药业有限公司）；TTC 溶液（江苏维尔生物科技有限公司）；多聚甲醛（江苏维尔生物科技有限公司）；miRCURYTM 芯片标记试剂盒（丹麦Exiqon 公司）；miRNAs 芯 片（丹 麦Exiqon 公 司）；BL-2000 图象分析（上海康为医疗科技发展有限公司）；Genepix 4000B 扫描仪（美国Affymetrix 公司）；引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；逆转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；SYBRGREEN PCR Mix（美国Applied Biosystems 公司）。

1.3 动物模型制备与评定标准

参照改良版Zea Longa[8]线栓法复制大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。除正常组外，其余大鼠均于造模前12 h 禁食不禁水。

造模组（CIRI 组及CIRI+针刺组）予10%现配水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，大鼠取仰卧位绑定至鼠板，备皮消毒沿颈部正中做约1～2 cm纵行切口，逐层分离皮下组织，沿胸锁乳突肌内侧缘分离右侧颈总动脉（common carotid artery, CCA），颈内动脉（internal carotid artery, ICA）及颈外动脉（external carotid artery, ECA），鱼线结扎CCA 及ECA近心端，于CCA 远心端（距分叉口约1 cm 左右）用眼科剪做微小切口并沿ICA 方向插入线栓直至线栓黑色标记至分叉口并感受阻力即可，然后永久结扎右侧ICA 以防止线栓脱落，伤口处用青霉素粉处理并缝合。 2 h 后小心取出线栓约1 cm，即完成CIRI模型制备，行神经功能症状缺损评分。Sham 组所有步骤同前，线栓只插入但不阻断大脑中动脉。术后单笼饲养并保温，自然清醒后，待生命体征稳定，所有大鼠行神经功能症状缺损评分。

模型成功评定标准[9]：未见神经功能缺损症状为0 分；提尾时，大鼠病灶对侧上肢向胸前内侧屈曲为1 分；行走时，大鼠向病灶对侧转圈为2 分；行走时，大鼠向病灶对侧倾倒为3 分；无自发行走或意识丧失为4 分。评分为1～3 分者视为模型制备成功，未成功者按相同造模方法补足造模大鼠数量。

1.4 干预方法

所有大鼠于缺血再灌注2 h 后进行相应干预，具体如下： 正常组不予处理；Sham 组及CIRI 组于鼠板上固定大鼠四肢30 min，每12 h/次，不针刺；CIRI+针刺组于鼠板上固定大鼠四肢后，参照《实验针灸学》[10]于人中、百会、大椎穴行针刺，每12 h/次，共6 次。

1.5 指标检测

1.5.1 神经功能症状缺损评分 分别于模型制备完成后、针刺治疗后对大鼠进行神经功能症状缺损评分。1.5.2 脑梗死面积比检测 于每组随机选取5 只大鼠麻醉后取材（全脑）、冲洗，冰冻30 min 后切片，避光染色15～30 min，多聚甲醛固定，进行肉眼观察及数码相机拍片，应用image pro plus 6.0 测量脑梗死面积，并参照Swanson 法[11]校正梗死面积并计算梗死面积百分比（IS%）。

计算公式：IS%=(SI-Sr)/2SI×100%（SI：脑片健侧总面积；Sr：患侧非梗死面积）

1.5.3 基因芯片检测 于每组随机选取5 只大鼠麻醉后取材（患侧海马组织），分离、标记及浓缩microRNA，microRNA 芯片杂交，最后进行图像扫描并分析。

1.5.4 qPCR 检测 于每组随机选取5 只大鼠麻醉后取材（患侧海马组织）进行RNA 提取及反转录、qPCR 检测。

1.6 统计方法

应用SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析。 数据不服从正态分布，采用非参数检验，以中位数（四分位间距）[M(Q)]表示，服从正态分布，以“±s”表示，方差齐者用单因素方差分析，两两比较LSD 法；方差不齐用Tamhane’s T2 法。 组内自身前后比较：正态分布则使用配对t 检验；否则使用配对秩和检验。

2 结果

2.1 针刺对CIRI 大鼠神经功能症状缺损评分的影响

治疗前，与正常组比较，Sham 组神经功能症状缺损评分差异无统计学意义(P＞0.05)，CIRI 组及CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分显著上升(P＜0.01)；与Sham 组比较，CIRI 组及CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分显著上升(P＜0.01)；与CIRI 组比较，CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后，与正常组比较，Sham 组神经功能症状缺损评分差异无统计学意义(P＞0.05)，CIRI组及CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分显著上升(P＜0.01)；与Sham 组比较，CIRI 组及CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分显著上升(P＜0.01)；与CIRI 组比较，CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分明显下降(P＜0.05)。与治疗前比较，正常组、Sham 组及CIRI 组的神经功能症状缺损评分差异均无统计学意义(P＞0.05)；而CIRI+针刺组神经功能症状缺损评分显著下降(P＜0.01)。 详见表1。

表1 针刺对CIRI 大鼠神经功能症状缺损评分的影响

2.2 针刺对CIRI 大鼠脑梗死面积比的影响

与正常组比较，Sham 组脑梗死面积比差异无统计学意义(P＞0.05)，CIRI 组及CIRI+针刺组脑梗死面积比显著增大(P＜0.01)；与Sham 组比较，CIRI 组及CIRI+针刺组脑梗死面积比显著增大(P＜0.01)；与CIRI组比较，CIRI+针刺组脑梗死面积比明显缩小(P＜0.05)。详见表2。

表2 针刺对CIRI 大鼠脑梗死面积比的影响[M（Q）]

2.3 针刺对CIRI 大鼠缺血侧海马区miRNA 表达的影响

2.3.1 miRNA 表达谱 每组随机筛选3 个样本，进行每两组间的差异miRNA 筛选，计算每个miRNA的显著性水平（P＜0.05）。经组间两两比较共发现62个差异miRNA，归并同种类miRNA，其聚类分析图见图1。

图1 差异miRNA 聚类分析图

2.3.2 差异表达miRNA 的种类 与正常组比较，CIRI 组差异表达4 个miRNA，分别是rno-miR-137-3p、rno-miR-136-3p、rno-miR-20a-5p 及rno-miR-338-5p；与Sham 组比较，CIRI 组差异表达5个miRNA，分别是rno-miR-344b-1-3p、rno-miR-383-5p、rno-miR-331-3p、rno-miR-323-3p 及rno-let-7d-5p；与CIRI 组比较，CIRI+针刺组差异表达16个miRNA，分 别 是rno-miR-22-5p、rno-miR-106b-5p、rno-miR-34c-5p、rno-miR-376c-5p、rno-miR-34c-3p、rno-miR-204-5p、rno-miR-1298、rno-miR-34b-3p、rno-miR-378a-3p、rno-miR-7a-5p、rno-miR-539-3p、rno-miR-130a-3p、rno-miR-331-3p、rnolet-7f-5p、rno-let-7d-5p、rno-let-7i-5p。

2.3.3 差异表达miRNA 的功用 与正常组比，CIRI组2 个差异miRNA 具有调节细胞增殖功能，3 个差异miRNA 具有调节细胞凋亡功能；与CIRI 组比，CIRI+针刺组多数差异表达miRNA 涉及调控细胞增殖及细胞凋亡功能，具体表现为：12 个差异miRNA 可调控细胞增殖，10 个差异miRNA 可调控细胞凋亡，6 个差异miRNA 可调控炎症反应，5 个差异miRNA 可调控基因表达，均有3 个差异miRNA可调控基因表达及神经元分化。 且CIRI 组与CIRI+针刺组均促使具有调控细胞增殖及细胞凋亡功用的miRNA 发生差异表达，其中CIRI+针刺组具有上述两种功用的差异miRNA 增加更为明显。 详见表3。

表3 各组间差异miRNA 的种类比较分析

2.4 针刺对CIRI 大鼠缺血侧海马区miR-20a-5p和miR-22-5p 的影响

与正常组比较，Sham 组miR-20a-5p 及miR-22-5p 的 表 达 差 异 无 统 计 学 意 义（P＞0.05），CIRI组miR-20a-5p 的表达显著上调（P＜0.01），miR-22-5p 的表达显著下调（P＜0.01）；与Sham 组比较，CIRI组miR-20a-5p 的表达显著上调（P＜0.01），miR-22-5p 的表达明显下调（P＜0.05）；与CIRI 组比较，CIR I+针刺组miR-20a-5p 的表达显著下调（P＜0.01），miR-22-5p 的表达明显上调（P＜0.05）。 详见表4。

表4 针刺对CIRI 大鼠缺血侧海马区miR-20a-5p和miR-22-5p 的影响(±s)

表4 针刺对CIRI 大鼠缺血侧海马区miR-20a-5p和miR-22-5p 的影响(±s)

注：与正常组比较，**P＜0.01；与Sham 组比较，#P＜0.01，##P＜0.01；与CIRI 组比较，&P＜0.05，&&P＜0.01

组别正常组Sham 组CIRI 组CIRI+针刺组n 55 55 miR-20a-5p 0.67±0.04 0.71±0.11 1.09±0.15**##0.73±0.21&&miR-22-5p 0.89±0.19 0.69±0.18 0.41±0.11**#0.73±0.21&

3 讨论

脑缺血再灌注从多方面、多水平危及人们的健康及生命安全。 而现代医学研究也试从多个方面研究CIRI 的治疗机制，既包括宏观结构的构建，如改善脑水肿情况、重建新生血管等[11-12]，也包括微观分子水平的调节，如细胞凋亡蛋白分子、炎性因子等的调节[13-14]。作为内源性RNA，miRNA 通过降解或抑制蛋白翻译过程进而使蛋白功能缺失。 miRNA 广泛分布于中枢神经系统中[15]，与CIRI 病情发展息息相关[16]。而针刺促CIRI 修复机制丰富且疗效明确[17]。近年来，不少研究发现针刺同样会对miRNA 的表达产生影响。如柳维林[18]研究发现，电针可以干预miR-219a 的表达，从而改变相关记忆蛋白合成情况。

本实验研究结果表明，CIRI 后，大鼠神经功能缺损评分及脑梗死面积比明显升高，提示模型制备成功；同时针刺人中、百会、大椎穴可明显降低大鼠神经功能缺损评分及脑梗死面积比，提示针刺可改善CIRI 大鼠神经功能症状及脑梗死面积。本次研究还发现CIRI 后，有4 个miRNA 差异表达且涉及细胞增殖和细胞凋亡两项功用，证明miRNA 在此过程中扮演了重要角色，且主要涉及细胞增殖和细胞凋亡功用的改变；而针刺人中、百会、大椎穴后，与CIRI 组比，CIRI+针刺组差异表达16 个miRNA，其功能除包括调控细胞增殖、细胞凋亡外，还涉及调节炎症反应、基因表达、神经元分化及轴突延伸等多种作用；此外，CIRI 组与CIRI+针刺组均促使了具有调节细胞增殖及细胞凋亡功用的miRNA 差异表达，并且根据表3 结果，CIRI+针刺组可激发更多具有调控细胞增殖和细胞凋亡作用的miRNA 发生差异表达。以上结果提示针刺从多层面、多系统抗CIRI 作用主要与针刺激发具有调控细胞增殖及细胞凋亡功用的miRNA 差异表达相关，这与相关研究结果也是一致的，针刺督脉穴位影响细胞增殖、细胞凋亡及炎性因子表达等对CIRI 具有重要调节作用[19-21]。

miRNA 稳定存在于血循环中，其表达量随着机体病理生理变化而发生改变[22]。 miR-20a-5p 作为miR-17 家族成员之一，缺氧/复氧的环境可促使miR-20a-5p 表达上调，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，从而加重脑组织损伤[23-24]。miR-22-5p 被认为是心肌梗死的重要标志物，有研究发现其在脑缺血后2 h表达明显下调[25-26]。 本研究基于miRNA 功用的分析和miRNA 芯片检测高表达量，选取miR-20a-5p和miR-22-5p 进行论证实验。 与正常组比较，CIRI 组miR-20a-5p 的表达量显著上调，miR-22-5p 的表达量显著下调，说明脑缺血再灌注后miR-20a-5p 的高表达与miR-22-5p 的低表达与脑组织损伤有关。 而针刺人中、百会、大椎穴后，与CIRI 组比，CIRI+针刺组miR-20a-5p 表达量降低，miR-22-5p 表达量增高，说明针刺CIRI 大鼠可下调miR-20a-5p 及上调miR-22-5p 的表达，使二者发挥益于受损组织恢复功能，从而促进脑组织梗死灶缩小、神经功能症状改善。

综上所述，针刺人中、百会、大椎穴能明显改善CIRI 大鼠的神经功能评分及脑梗死面积比，促CIRI后修复，其机制或与激发多种类、多功能miRNA的改变，特别是与下调miR-20a-5p、上调miR-22-5p 的表达量促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的有关。