冰草属典型二倍体物种及其种间杂种F2 代核型分析

左学丽，李旭青，杨海宁，杨燕萍，魏 莱，曾丽倩，车永和

（1.河北科技师范学院 农学与生物科技学院/河北省作物逆境生物学重点实验室（筹），河北 秦皇岛 066000； 2.青海省互助北山林场 青海 海东 810500）

冰草属（Agropyron）植物属于禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）中的一种［1］，我国冰草属物种主要分为冰草（A. cristatum L.）、沙生冰草（A. desertorum ＜Fisch.＞ Schult.）、 根 茎 冰 草（A. michnoi Roshev.）、西伯利亚冰草（A. fragile ＜Roth＞ Canad.）、蒙古冰草（A. mongolicum Keng）5 个种，以及多花冰草（A. cristatum var. lurflorum）、光穗冰草（A. cristatum var. pecriforme）、毛沙生冰草（A. desertorum var. pilosiusculum）、和毛沙芦冰草（A. desertorum var. vilosum）4 个变种和毛稃冰草（A. sibiricumf. pubiflorum）1 个变型。其中冰草是冰草属中分布范围最广泛的1 个种，是冰草属代表物种，而蒙古冰草分布于我国的内蒙古，陕西等地区，适应于干燥的草原或沙地，是我国1 个特有种［2］。

冰草属植物作为优异的小麦三级基因源，在小麦与冰草远缘杂交染色体间关系研究上［3-8］有较多研究报道。有目的的导入冰草外源基因为小麦育种和品种改良提供了新的途径［9］，小麦冰草远缘杂交系统深入研究不仅为小麦异染色体材料的鉴定和利用提供了有用的工具，而且为小麦育种和改良提供了新的种质资源。针对冰草属植物细胞学［10］、分子生物学［11-12］、基因组学［13］等方面的研究报道相对还是较少。关于冰草属的分类在学术界始终存在分歧，对冰草属植物在基因组系统进化方面依然还存在较大争论［14-16］。针对冰草与蒙古冰草杂种后代研究有助于阐明沙生冰草、根茎冰草等冰草属多倍体物种起源进化，在冰草属植物系统演化中有重要研究意义。

核型分析作为一种常用的细胞分析方法，能对植物进化程度，种属间的亲缘关系更好地分类，但目前尚没见对冰草属典型二倍体物种间的核型分析报道。本研究针对冰草属两个典型二倍体物种冰草和蒙古冰草及其种间杂种的F2代核型进行分析，以期确定研究材料的染色体组成及多态性情况、为冰草属植物遗传多样性和系统进化等提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料由中国农科院作物研究所提供，以蒙古冰草（A. mongolicum）Z2098 为母本与二倍体冰草 （A. cristatum）Z1842 为父本进行人工杂交获得种间杂种F1代群体。试验材料种植于河北科技师范学院农场。对父母本及在F1代种间杂种群体116 个单株中随机选取3 个单株的结实种子，即F2代材料进行发根。

1.2 细胞学制片方法

每份冰草材料挑选籽粒饱满、无病虫害50 种子，清水洗后放于双层滤纸培养皿内室内进行发根。具体方法参照代明等染色体核型分析方法［17］。

1.3 染色体核型分析方法

参照李懋学等确定的染色体核型分析标准［18］，对图像编号并测量相对长度、臂比、核型类型及核不对称系数等指标［19-21］。

2 结果与分析

2.1 染色体数目分析

每份材料选择对50 个分散良好的细胞观察计数（图1 ～5），其中父本冰草Z1842 中有43 个细胞染色体数目为14 条，占统计总数的86%，5 个细胞染色体数目为12 条，2 个细胞染色体数目为10条，分别占统计总数的10%和4%。母本蒙古冰草Z2098 中有43 个细胞染色体数目为14 条，占统计总数的86%，4 个细胞染色体数目为12 条，3 个细胞染色体数目为11 条，分别占统计总数的8%和6%。随机选取的杂种F2-19 中有43 个细胞染色体数目为14 条，3 个细胞染色体数目为12 条，2 个细胞染色体数目为10 条，2 个细胞染色体数目为7 条，分别占统计总数的86%、6%、4%、和4%。杂种F2-69中有43 个细胞染色体数目为14 条，有4 个细胞染色体数目为12 条，有3 个细胞染色体数目为9 条，分别占统计总数的86%、8%和6%。杂种F2-94 中有44 个细胞染色体数目为14 条，有1 个细胞染色体数目为13 条，有5 个细胞染色体数目为12 条，占统计总数的88%、2%和10%。根据染色体核型分析标准，85%以上的细胞具有恒定不变的染色体数目时认定为该植物体的染色体数目，因此确定本研究冰草属两个代表物种及其种间杂种F2代的染色体数目为2n=2x=14。

图1 冰草Z1842 的核型分析图Fig. 1 Karyotype analysis of A. cristatum Z1842

图2 蒙古冰草Z2098 的核型分析图Fig. 2 Karyotype analysis of A. mongolicum Z2098

图3 冰草杂种F2-19 的核型分析图Fig. 3 Karyotype analysis of the Agropyron hybrid F2-19

图4 冰草杂种F2-69 的核型分析图Fig. 4 Karyotype analysis of the Agropyron hybrid F2-69

图5 冰草杂种F2-94 的核型分析图Fig. 5 Karyotype analysis of the Agropyron hybrid F2-94

2.2 染色体核型分析

用Photoshop 软件每份材料测量5 个细胞染色体的长臂、短臂长度，取平均值，并计算每条染色体的臂比值（长臂/短臂），确定着丝粒位置类型，分析结果见表1 和表2。

表1 冰草属物种及其种间杂种F2 代染色体核型参数Table 1 Karyotype parameters of Agropyron spp. and the interspecific hybrid F2

续表：

表2 研究材料的染色体核型对比Table 2 Comparison of karyotypes of the study materials

2.2.1 冰草杂种父本的核型 在父本冰草Z1842 材料中，染色体相对长度最长的为16.20%，最短的为12.41%，比值为1.31；臂比中最长臂比为1.8，最短的臂比为1.51，不存在臂比值大于2.1 的染色体，属于“1A”型；Z1842 染色体的不对称系数为61.70%，对称性较强，属于较对称类型范围。第5、6 对染色体着丝点在近中部染色体区域，其余着丝点在中部染色体区域，核型公式为2n=2x=10m+4sm。

2.2.2 冰草杂种母本的核型 在母本蒙古冰草Z2098 中，染色体相对长度最长的为18.13%，最短的为11.95%，比值为1.52；臂比中最长臂比为1.74，最短的臂比为1.52，不存在臂比值大于2∶1 的染色体，属于“1A”型；Z2098 染色体的不对称系数为62.10%，对称性较强，属于较对称类型范围。第2、3、6、7 对染色体的着丝点在中部染色体区域，其余染色体的着丝点在近中部染色体区域，其核型公式为2n=2x=8m+6sm。

2.2.3 冰草杂种F2-19 号的核型 在冰草杂种19 号中，染色体相对长度最长的为18.84%，最短的为12.30%，比值为1.53；臂比中最长臂比为1.64，最短的臂比为1.32，不存在臂比大于2∶1 的染色体，属于“1A”型；冰草杂种母本材料染色体的不对称系数为59.27%，对称性较强，属于较对称类型范围。7 对染色体的着丝点在中部染色体区域，核型公式为2n=2x=14m。

2.2.4 冰草杂种F2-69 号的核型 在杂种69 号中，染色体相对长度最长的为16.34%，最短的为12.86%，比值为1.27；臂比中最长臂比为2.08，最短的臂比为1.73，有2 对臂比大于2∶1 的染色体，属于“2A”型；杂种69 号材料染色体的不对称系数为64.90%，对称性较强，属于较对称类型范围。全部染色体的着丝点在近中部染色体区域，核型公式为2n=2x=14sm。

2.2.5 冰草杂种F2-94 号的核型 在冰草杂种94 号中，染色体相对长度最长的为21.37%，最短的为10.65%，比值为2.01；臂比中最长臂比为2.03，最短的臂比为1.34，有2 对臂比大于2∶1 的染色体，属于“2A”型；冰草杂种94 号材料染色体的不对称系数为64.51%，对称性较强，属于较对称类型。除了第1、2、3 和4 对染色体的着丝点在中部染色体区域，其余染色体的着丝点在近中部染色体区域，核型公式为2n=2x=6m+8sm。

2.3 染色体核型聚类分析

聚类分析研究表明（图6），在欧式距离为2处，可将研究材料分为三类，种间杂种F2-69 和F2-94 为一类，核不对称系数较高，分别为64.90%和64.51%，表明遗传差异大，进化程度较最高。父本Z1842 与母本Z2098 为一类，核不对称系数居中（61.70%、62.10%），进化程度小于F2-69 和F2-94。F2-19 号单独为一类，核不对称系数最低（64.51%），进化程度最低。在欧式距离13 处，可将5 份研究材料分为两类，父本、母本与F2-19 号材料为一类，核型类型为1A 型；其余的材料为一类，核型类型为2A 型。

图6 研究材料聚类分析Fig. 6 Cluster analysis of the study materials

3 讨论与结论

细胞学作为植物遗传多样性的一种研究方法，是通过比较染色体的数目及结构的变化，来反映染色体的遗传规律。核型分析是定性和定量的分析和研究生物的染色体核型，在植物细胞的核型分析中，主要是从染色体的全长、臂长、着丝点位置以及特殊的结构几方面进行研究的［22-23］。通过研究和对比物种间的染色体核型来确定本物种的自身遗传特征，为物种间的系统演化与亲缘关系的判断提供理论依据。本研究结果表明，冰草属蒙古冰草和冰草及其杂种后代F2材料体细胞染色体数目都为2n=2x=14，其核对称水平都较高，染色体相对长度、臂比、不对称系数都有一定的差异。相关研究中，对冰草居群细胞学核型分析发现不同居群之间存在着较大的遗传差异性［24］；冰草染色体核型主要由中部着丝点（m）和近中部着丝点染色体（sm）所组成，中部着丝点染色体是冰草核型的主要组成部分［25］。这些研究结果与本试验研究结果相一致。本研究发现冰草属2 个典型二倍体物种冰草和蒙古冰草及其种间杂种后代材料核型均属于基本对称类型。本研究采用种间杂种后代遗传分化最为显著的一个分离世代F2代进行了取样研究，通过研究发现形成的后代具有相似的核型特征。研究结果也进一步验证了冰草属物种具有相似基因组构成，参照前人研究结果可能由同一基因组演化为不同种及类型［26-27］。

整个植物界中核型进化的基本趋势是从对称型发展为不对称型，大多数较为原始的植物具有更对称的核型，而不对称的核型在衍生或进化的高级植物中更常见［28］。同一属不同物种之间核型的演变时经常表现出多种形式，在大多数种情况下核型也由对称演变为不对称，而少数植物则相反。本研究的5 份材料中核不对称系数最低的是冰草杂种F2-19号材料为59.27%，核型类型为1A；核不对称系数最高的是冰草杂种F2-69 号材料为64.90%，核型类型为2A；冰草和蒙古冰草的核不对称系数居中。分析造成本研究材料间核型差异的原因可能主要有，冰草是异花授粉植物具有严格自交不亲和性，致使每份材料相对都是一个杂合体；授粉过程中，不同 种、开花时间、天气状况等不同都会直接或间接的影响植物的授粉，导致其遗传基础就比较复杂；可能不同种材料或是同一种材料应用不同的处理方式，也会造成实验结果的不同；另外，从生物进化论的观点来看，任何物种都不是一成不变的，由于同一物种的生活环境不同，可能会导致染色体水平变 化［29］。相关研究还有待于进一步深入。

冰草作为一种牧草和小麦遗传改良的重要资源，物种细胞学的多样性也显示了物种基因水平的多样性。本研究中不同材料之间染色体核型多态性丰富，研究对冰草属植物种质的系统进化，种间关系以及遗传多样性提供了一定理论依据，也为进一步拓宽牧草植物育种遗传基础提供了一定借鉴意义。