miRNA-455-3p 在三阴性乳腺癌患者血清中的意义及其与预后关系的临床研究
2020-10-30张欢梁波王雄郑德泉
张欢 梁波 王雄 郑德泉
乳腺癌在女性恶性肿瘤中最为常见,其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)即孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)表达均为阴性的乳腺癌,虽然仅占到所有乳腺癌病理类型的10%~20.8%,但其侵袭早、转移快、病死率高的特点已经成为乳腺癌诊断、治疗的难点和研究热点[1]。由于TNBC 缺乏特异性分子标志物,大多数患者发现时已是中晚期,治疗效果不理想,致使该病5年生存率不足30%[2]。因此,寻找新型、高效、准确的分子标记物,尽可能在早期对疾病进行干预治疗,有可能成为改善患者预后、延长生存期的关键。
MicroRNA(miRNA)属于内源性非编码RNA,目前已知miRNA 约1 000 种,约50%的miRNA 位于与肿瘤相关的脆弱性位点或区域,提示miRNA 可能与肿瘤的发生密切相关[3,4]。已有研究证实[5,6],miRNA-455-3p 与多种肿瘤的发生密切相关,但对TNBC 疾病发生发展的影响却少有报道。本研究通过探讨血清miRNA-455-3p 水平在TNBC 患者中的临床意义,并分析其与临床预后的关系,为临床诊断评估提供参考。
1 材料与方法
1.1 一般资料选取2015 年5 月~2017 年3 月我院胸外科经病理学诊断证实为TNBC 患者80 例为TNBC 组,年龄30~75 岁,平均(56.86±12.48)岁;选取同期我院体检中心志愿者80 例为对照组,年龄30~75 岁,平均(57.21±13.52)岁。两组年龄无统计学差异(P>0.05)。观察组肿瘤分型:浸润性导管癌55 例,浸润性小叶癌17 例,其他类型乳腺癌8例。TNM 分期:Ⅰ~Ⅱ期32 例,Ⅲ期48 例;淋巴结转移56 例,无淋巴结转移24 例。
1.2 实验试剂与仪器RNA 提取试剂购自Invitrogen Ambion 公司;SYBR Green 荧光染料试剂盒购自莫赛飞公司;H2O2水(Sigma 公司);5804R 型高速冷冻离心机购自Eppendorf 公司;FTC3000 型RT-PCR 仪购自Funglyn Biotech 公司;9UV752 型紫外可见光光度计(上海佑科公司)。
1.3 Real-time PCR 检测miRNA-455-3p 血清水平miRNA-455-3p 引物由衡阳潇湘博睿科技服务有限公司合成,检测两组患者血清中miRNA-455-3p的表达。miRNA-455-3p 引物序列参考NCBI Gene数 据 库,miRNA-455-3p 引 物:F:5'-CGTCGAAGA AGGGCAAGTAG-3',R:5'-CACCATTCCAAGCAC AACAC-3';内参U6 引物:F:5'-CTCGCTTCGGCAG CACA-3',R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照采买的RNA 提取试剂盒说明书操作,先提取血清总RNA,鉴定总RNA 浓度(紫外分光度法),5min内加热至70℃,冷却2min,离心后依次加入Buffer、RNasin 及M-MLV,混匀后25℃温浴10min,42℃温浴50min,95℃加热5min,终止反应,可得20μl cDNA。取1μl cDNA 模板,miRNA-455-3p 上下游引物各加入0.5μl,加入到10μl SYBR GREEN 中,最后用ddH2O 补齐至20μl 进行PCR 循环。反应结束后经95 ℃ 10min,60 ℃ 20s,72 ℃ 30s,4 ℃5min,循环40 次,每个基因样品行3 个孔平行试验,实验结果采用2-△△Ct 法分析。
1.4 研究方法由本科室主治医师详细询问病史,完整收集患者临床资料,对比TNBC 组和对照组患者血清miRNA-455-3p 表达水平;采用ROC 曲线分析血清miRNA-455-3p 水平对TNBC 的诊断效应及miRNA-455-3p 截断值;分析术前血清中miRNA-455-3p 表达水平与TNBC 患者临床病理学之间关系,并记录患者术后3 年内复发例数及死亡例数,分析血清中miRNA-455-3p 异常表达是否为TNBC 患者术后3 年内复发及死亡的危险因素。末次随访日期为2020 年4 月,中位随访时间为36.2个月。
1.5 统计学方法应用SPSS 19.0 软件进行数据统计,计量资料以表示,两组间比较采用t检验,计数资料采用χ2检验;Kaplan-Meier 法计算TNBC患者累计生存时间,Log-rank 检验进行生存分析,根据Cox 风险回归模型进行单因素和多因素分析,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者血清miRNA-455-3p 表达水平情况TNBC 组患者血清miRNA-455-3p 相对表达量为(1.53±0.34),低于对照组(6.31±1.03),差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 血清miRNA-455-3p 对TNBC 的诊断效应分析miRNA-455-3p 曲线下面积为0.746,95%CI(0.652,0.779),Youden 指数为0.433,截断值为2.06(高于截断值为高表达,低于截断值则为低表达),miRNA-455-3p 对TNBC 诊断的敏感度和特异度分别为72.4%和68.9%,见图1。
图1 血清miRNA-455-3p 表达对TNBC 诊断的ROC 曲线
2.3 血清miRNA-455-3p 表达水平与TNBC 的临床病理学分析临床病理学分析结果显示,血清miRNA-455-3p 表达与TNM 分期、血管侵犯、淋巴结转移及术后3 年内复发有关,差异有统计学意义(P<0.05),而与患者年龄、肿瘤类型及是否绝经无关,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
表1 血清miRNA-455-3p 表达水平与TNBC 的临床病理学分析
2.4 血清miRNA-455-3p 表达与TNBC 术后复发和预后的关系经随访,TNBC 患者术后3 年内复发58 例,死亡45 例,其中血清miRNA-455-3p 高表达复发20 例,死亡9 例,复发率及死亡率分别为25.00%和11.25%,低表达复发38 例,死亡36 例,复发率及死亡率分别为47.50%和45.00%。与血清miRNA-455-3p 高表达患者比较,血清miRNA-455-3p 低表达患者复发率及死亡率均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。Cox 单因素回归分析结果:TNM 分期、肿瘤有血管侵犯、淋巴结转移及血miRNA-455-3p 低表达是影响TNBC 患者术后3 年内复发和总体生存率的危险因素(P<0.05);Cox 多因素回归分析结果:肿瘤有血管侵犯、淋巴结转移及血miRNA-455-3p 低表达是预测TNBC 患者术后3 年内复发和总体生存率的危险因素(P<0.05),且血清miRNA-455-3p 低表达是TNBC 患者术后3年内复发和死亡率升高的独立危险因素(P<0.05),见表2、3。
表2 TNBC 术后3 年内复发及总体生存预估的单因素分析
表3 TNBC 术后3 年内复发及总体生存预估的多因素分析
3 讨论
TNBC 相对其他乳腺癌术后复发率及死亡率均较高,严重威胁女性健康,是乳腺癌患者死亡的主要因素之一[7]。有研究表明[8],TNBC 异质性较强,临床亚型较多,将其视为一种疾病已不符合精准医学的概念,称之为“一类疾病”更为准确。由于其亚型众多,发病机制各不相同,很难找到一种理想的分子标记物对TNBC 进行早期诊断及预后评估。因此,寻找新的高效、稳定的TNBC 评估标记物仍是亟待解决的热点问题。miRNAs 在外周血中的表达具有极强的稳定性,已成为目前临床寻找高效疾病分子标记物的新方向。虽然外周血中miRNA 的具体来源尚无定论,但miRNAs 的部分调控作用已进行了大量而深入的研究,目前已在多种炎症、恶性肿瘤及自身免疫性疾病的诊断和预测中显示了独特的应用价值[9~11]。周冬冬等[12]研究发现,老年TNBC 患者血清中miRNA-21、miRNA-200a、miRNA -200b 均出现异常表达,其中miRNA-21、miRNA-200a 明显升高,miR-200b 水平明显下降,并且其变化趋势与肿瘤的分期、分型及转移情况密切相关,在一定程度上可预测TNBC 术后转归情况。近些年由于科学检测技术的突飞猛进,miRNAs 芯片技术筛选已然成熟,虽然尚未阐述清楚差异miRNAs 在肿瘤发生及发展中的作用机制,但已经为肿瘤发病机制的精准研究提供了新方向[13]。
miRNA-455-3p 是染色体脆弱性位点9q32 区域唯一一个miRNA,已证实其与乳腺癌、宫颈癌及胃癌的发生密切相关[6,14,15],但miRNA-455-3p 对于TNBC 的临床意义却少有报道。本研究首先对比TNBC 与健康志愿者血清中miRNA-455-3 表达水平,结果证实TNBC 患者血清中miRNA-455-3为低水平表达,说明低水平miRNA-455-3 可能是促进肿瘤发生的重要因素。应用ROC 曲线对miRNA-455-3 的诊断效能进行分析,曲线下面积为0.746,虽然未能达到0.9 以上,但足够说明miRNA-455-3 对TNBC 具有较高的诊断准确性。从临床病理学角度分析,TNBC 患者血清miRNA-455-3 的低表达可能与TNM 分期、淋巴结转移、血管侵犯程度及3 年内复发有关,因此,血清miRNA-455-3 表达水平对于TNBC 临床诊断及疾病进程分析具有一定的参考价值。在后续的研究中,我们通过对患者持续3 年随访,并记录患者复发率及死亡率,并采用单因素Cox 回归分析,发现TNM 分期、肿瘤有血管侵犯、淋巴结转移及血miRNA-455-3p 低表达是影响TNBC 患者术后3 年内复发和总体生存率的危险因素,但上述结果中,TNM 分期与淋巴结转移情况具有相互重叠性,难以进行准确的多因素分析,故而在多因素分析中去除由“多条件”共同制定的TNM 分期。多因素Cox回归分析证实肿瘤有血管侵犯、淋巴结转移及血miRNA-455-3p 低表达是预测TNBC 患者术后3 年内复发和总体生存率的危险因素。刘益娟等[5]研究发现,miRNA-455-3p 可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。TNBC 患者血清miRNA-455-3 呈低表达,可能难以起到阻断PI3K/AKT 信号通路的作用,可能使PI3K/AKT 通过直接磷酸化多种转录因子促进肿瘤细胞的增殖、抑制凋亡并增强细胞的侵袭和转移能力[16]。TNBC的临床特点也是易转移、易复发,miRNA-455-3低表达后对肿瘤细胞的影响与TNBC 相同,因此miRNA-455-3 低表达可能是该病发生及发展的重要因素之一。
综上所述,TNBC 患者血清miRNA-455-3 低表达提示肿瘤可能存在侵袭、转移,并且与预后显著相关,是影响TNBC 患者术后复发率及生存率的独立危险因素。