硼硅酸盐生物玻璃浸提液对大鼠成骨细胞增殖分化的影响及其机制

何晓辉 陈武生 杨珩钦 詹建勇 庄一凡 庄鑫泓 罗辉 秦育滨

骨质疏松症是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。成骨细胞主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来，是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化[1]。因此，对成骨细胞进行保护在骨质疏松症的预防及治疗中具有非常重要的作用。硼硅酸盐生物玻璃作为新型的生物材料，不仅能够通过转化为羟基磷灰石来促进骨修复，还能通过硼酸盐诱导骨再生的活性来促进骨修复[2]。目前关于硼硅酸盐生物玻璃对成骨细胞增殖分化影响的研究报道很少见。基于此，本研究将通过探讨硼硅酸盐生物玻璃浸提液对大鼠成骨细胞的保护作用及其相关机制，为硼硅酸盐生物玻璃防治骨质疏松症及促进骨修复提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 ROS1728 大鼠成骨细胞由上海佰晔生物科技中心提供，货号 :SX-C1200。

1.1.2 仪器 CO2培养箱由德国美墨尔特公司生产；超净工作台由莱特（南通）科学仪器有限公司生产；凝胶成像系统由杭州朗基科学仪器有限公司生产；倒置荧光显微镜由日本奥林巴斯公司生产；实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测系统由美国Bio-Rad 公司生产。

1.1.3 试剂 培养基由上海佰晔生物科技中心生产；CCK-8 试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒、PCR 试剂盒及Western-blot 试剂盒由英国Abcam 公司生产。

1.1.4 硼硅酸盐生物玻璃浸提液 将硼硅酸盐生物玻璃材料的颗粒与高糖DMEM 培养基混合，比例为每3cm2硼硅酸盐生物玻璃颗粒加入1ml DMEM培养基，37℃条件下孵育浸提24h，收集浸提液、0.22μm 过滤除菌后4℃放置备用。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 实验 成骨细胞按3×103个/100μl 接种于96 孔培养板，培养箱中培养24h 后，加50μg/ml（高剂量组）、25μg/ml（低剂量组）浸提液各200μl 继续培养，以不加浸提液的完全培养基为对照组，培养成骨细胞24、48、72h，每孔加10μl CCK-8 溶液，置于CO2细胞培养箱中孵育2h 后，用酶标仪测定450nm吸光度值。

1.2.2 钙盐沉积量检测 成骨细胞按1×105个/孔接种于6 孔板中，细胞培养箱中培养24h 后，加50μg/ml（高剂量组）、25μg/ml（低剂量组）浸提液各200μl 继续培养，以不加浸提液的完全培养基为对照组，培养成骨细胞12、16d。取出培养板去除培养液，用PBS 洗一遍。每孔加入100μl 的样品裂解液。用枪吹打数下，使样品裂解液和细胞充分接触。充分裂解后，4℃，14 000g 离心5min，取上清，冰上放置待测。酶标仪测量570nm 处的吸光度，制作标准曲线，计算样品的钙浓度。

1.2.3 碱性磷酸酶染色 成骨细胞按1×105个/孔接种于6 孔板中，细胞培养箱中培养24h 后，加50μg/ml（高剂量组）、25μg/ml（低剂量组）浸提液各200μl 继续培养，以不加浸提液的完全培养基为对照组，培养成骨细胞6、9、12d。去除培养基，用PBS 清洗一次，然后用120μl 裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃，14 000g 离心5min，取上清，按照试剂盒步骤进行操作。加入标准品和样品（50μl），37℃孵育20min 后，每孔加入100μl 反应终止液终止反应。使用酶标仪在405nm 测定吸光度。

1.2.4 RT-PCR 法 成骨细胞按1×105个/孔接种于6 孔板中，细胞培养箱中培养24h 后，加50μg/ml（高剂量组）、25μg/ml（低剂量组）浸提液各200μl继续培养，以不加浸提液的完全培养基为对照组，培养成骨细胞9d。提取总RNA，行RT-PCR 法检测Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 的表达水平。引物序列表见表1。

表1 引物序列表

1.2.5 Western-blot 法 成骨细胞按1×105个/孔接种于6 孔板中，细胞培养箱培养24h 后，加50μg/ml（高剂量组）、25μg/ml（低剂量组）浸提液各200μl 继续培养，以不加浸提液的完全培养基为对照组，培养成骨细胞9d。提取总蛋白，测定PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白的表达。一抗：PI3K[Cell Signaling Technology（CST），3358，1∶1000]、p-AKT（CST，4058，1∶1000）、RUNX2（CST，12556，1∶1000）、beta-actin（CST，16275，1∶1000）。二抗：鼠抗（CST，7076，1∶1000），兔抗（CST，7074，1∶1000）。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组之间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度浸提液对成骨细胞增殖的影响培养24、48、72h 时，高剂量组与低剂量组成骨细胞增殖能力均明显高于对照组（P＜0.05），高剂量组成骨细胞增殖能力均明显低于低剂量组（P＜0.05），见表2。

表2 CCK-8 实验检测不同浓度浸提液对成骨细胞增殖的影响（，n=6）

表2 CCK-8 实验检测不同浓度浸提液对成骨细胞增殖的影响（，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与低剂量组比较，bP＜0.05

2.2 不同浓度浸提液对成骨细胞活力的影响培养6、9、12d 时，高剂量组与低剂量组成骨细胞活力均明显高于对照组（P＜0.05）；培养6、9d 时，高剂量组与低剂量组成骨细胞活力比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养12d 时，高剂量组成骨细胞活力明显高于低剂量组（P＜0.05），见表3。

表3 碱性磷酸酶染色检测不同浓度浸提液对成骨细胞活力的影响（，U/mg，n=6）

表3 碱性磷酸酶染色检测不同浓度浸提液对成骨细胞活力的影响（，U/mg，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与低剂量组比较，bP＜0.05

2.3 不同浓度浸提液对成骨细胞钙盐沉积量的影响培养12、16d 时，高剂量组与低剂量组成骨细胞钙盐沉积量均明显高于对照组（P＜0.05），高剂量组成骨细胞钙盐沉积量均明显高于低剂量组（P＜0.05），见表4。

2.4 不同浓度浸提液对成骨细胞基因mRNA 表达的影响高剂量组与低剂量组成骨细胞Wnt3a、β-catenin、BMP2 mRNA 表达水平均明显高于对照组（P＜0.05）；高剂量组与低剂量组成骨细胞Wnt3a mRNA 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量组与低剂量组成骨细胞β-catenin、BMP2 mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表4 不同浓度浸提液对成骨细胞钙盐沉积量的影响（，μg/ml，n=6）

表4 不同浓度浸提液对成骨细胞钙盐沉积量的影响（，μg/ml，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与低剂量组比较，bP＜0.05

表5 RT-PCR法检测不同浓度浸提液对Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 表达的影响（，n=6）

表5 RT-PCR法检测不同浓度浸提液对Wnt3a、β-catenin、BMP2 基因mRNA 表达的影响（，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与低剂量组比较，bP＜0.05

2.5 不同浓度浸提液对成骨细胞蛋白表达的影响高剂量组与低剂量组的成骨细胞PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表达水平均明显高于对照组（P＜0.05）；高剂量组的成骨细胞PI3K、RUNX2蛋白表达水平均明显高于低剂量组（P＜0.05），高剂量组与低剂量组的成骨细胞p-AKT、beta-actin 蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 Western-blot 法检测不同浓度浸提液对成骨细胞PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表达的影响

3 讨论

随着社会老龄化加剧，骨质疏松症的发病率已跃居世界各种常见疾病的第7 位，被公认为严重的社会公共健康问题。2018 年中国骨质疏松流行病学调查结果显示：我国50 岁以上人群骨质疏松症患病率为19.2%，65 岁以上人群骨质疏松症患病率达到32.0%[3]。因此，对骨质疏松症进行防治很重要。

生物材料被广泛应用于骨科疾病的临床治疗中，较好的生物相容性及能够对成骨细胞增殖分化起到诱导作用，是理想生物材料需要具备的特点[4]。硼硅酸盐生物玻璃是近年来兴起的一种新型生物材料，具有较好的生物活性和降解性能，能够为骨组织的再生提供生长所需要的营养物质、细胞因子及空间[5，6]。有研究显示，硼硅酸盐生物玻璃能够通过相关成骨信号通路诱导成骨细胞发生增殖[7]。为了进一步明确硼硅酸盐生物玻璃影响成骨细胞增殖分化的机制，我们通过研究发现，高剂量组与低剂量组的成骨细胞增殖能力、活力及钙盐沉积量均明显高于对照组，说明硼硅酸盐生物玻璃浸提液能够明显促进成骨细胞的增殖与分化，利于骨组织的再生与愈合。

Wnt 信号通路由一系列相互作用的分子组成，这些分子的相互作用及功能可通过调节成骨细胞的分化、增殖及功能而间接影响骨形成，若抑制Wnt信号通路转导可使成骨细胞分化进程受阻，从而抑制骨形成[8～10]；若诱导Wnt 家族成员表达则可使成骨细胞特异性基因表达增加，促进骨形成[11]。研究表明PI3K/AKT 信号通路在骨生长调节中通过调节碱性磷酸酶、骨钙蛋白和p-AKT 的表达发挥重要作用[12～15]。本研究中，与对照组比较，高剂量组与低剂量组的成骨细胞Wnt3a mRNA及PI3K、p-AKT、RUNX2、beta-actin 蛋白表达水平均明显增高，说明硼硅酸盐生物玻璃浸提液能够上调Wnt 信号通路及PI3K/AKT 信号通路，对成骨细胞有保护作用。

综上所述，硼硅酸盐生物玻璃浸提液能够促进大鼠成骨细胞的增殖分化，提高钙盐沉积量，其机制可能为通过激活Wnt 及PI3K/AK 信号通路而发挥作用。但是没有确定最优浓度，还需要进一步深入研究。