不同提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定的影响

盛璐 黄媛媛 张茜茹

摘 要：研究不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定的影响.以铁线莲“亲爱的”叶片为试验材料，用5种不同处理提取液对其进行浸提试验和光稳定性试验，紫外可见分光光度计测定铁线莲“亲爱的”叶绿素含量，根据测定的叶绿素含量差异，就不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量提取效果和光稳定性进行分析.结果得出：丙酮：无水乙醇=1：1提取液提取效果最好、光稳定性较好;95%乙醇提取液光稳定性最好.即丙酮：无水乙醇=1：1提取液为铁线莲“亲爱的”中叶绿素的含量测定的最佳试剂，且该试验为铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定方法提供理论依据，为该品种进一步研究提供参考价值.

关键词：铁线莲“亲爱的”;叶绿素;浸提法

中图分类号：Q946  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）08-0013-04

铁线莲（Clematis L.）隶属于毛茛科（Ranunculaceae），是园林中常见的绿化藤本或木本植物[1]，因其花色丰富且花型大而好看，是园林观赏中优良品种，被赋予“藤本花卉皇后”称号.植物在其生长发育阶段，通常会受到人为和自然因素的影响，如水分、气候、叶绿素含量等.叶绿素是植物生长发育过程中所需的重要物质，是进行光合作用的主要色素[2，3].同时叶绿素含量变化可以作为植物生长状态的评判依据，还可以为植物的栽培养护管理提供指导依据.由此可知，关于植物叶绿素含量测定的研究尤为重要.叶绿素是一类存在于地球上几乎所有生物体含有的色素，根据国内外关于叶绿素的提取方法的研究报道，常用的为研磨法和浸提法两种，还有微波辅助法、超声波浸泡法等提取方法[4-6]结合实验室器材和国内外许多试验所用方法考虑，本试验采取浸提法提取叶绿素，选用分光光度计法测定叶绿素含量.

据研究报道，全球约有该属植物355种[7].我国现已有147种，存在于全国各地.目前国内外对于铁线莲属植物的研究，主要集中于细胞学、分类学、药用价值研究、园林应用等方面.其中对于对铁线莲“亲爱的”这一新品的报道较少，且对于铁线莲叶绿素含量测定方面的研究更少.目前关于这一品种的叶绿素测定的研究还未见报道.本试验选取铁线莲“亲爱的”为实验材料，研究不同处理的提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定的影响.主要采用浸提法提取叶绿素，紫外可见分光光度计测定叶绿素含量.分析不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量提取效果，并对提取叶绿素后的提取液进行光稳定性试验，旨在选出提取铁线莲“亲爱的”叶绿素含量的最佳试剂，为铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定的提取液选择提供依据，为准确地测定叶绿素含量对其生长发育影响以及逆境胁迫等试验提供一定的理论基础，并为该品种的生长发育和栽培养护提供指导意见.

1 材料和方法

1.1 材料

铁线莲“亲爱的”叶片采摘于3月中旬（正值叶片生长阶段）在滁州学院土木与建筑工程学院三楼东边阳台处，挑选的均为生长发育良好、无病虫害的较为成熟的叶片若干.

1.2 试剂与仪器

选用的纯度规格为分析纯的丙酮和无水乙醇试剂，取实验室蒸馏水作为试验用水;752型紫外可见分光光度计、FA2014A电子天平和光径为10mm的石英比色皿等主要仪器.

1.3 试验设计

本试验采用浸提法，根据上述试剂按体积比配制5种提取液各500ml，互为对照（表2-1）.

1.4 试验方法

1.4.1 浸提试验

将采摘的铁线莲“亲爱的”叶片，去除叶缘、叶梗和大叶脉后用蒸馏水进行清洗，用滤纸吸干表面水分.再将叶片剪成碎条[5]放置在滤纸上混匀.随后利用电子天平，准确称取5份2.0g碎条放置备用;用量筒玻璃棒准确量取上述5个处理的提取液各20ml于试管中，随即将称取好的碎条放入提取液中并用试管塞塞紧，直接浸提并不时摇动，注意浸提均在黑暗中进行（本试验采用遮光黑幕布營造黑暗环境），并重复上述操作三次.当肉眼看到叶片组织完全变白时（由预实验得知约需要14h）即浸提完全，于是将提取好的提取液定容到25ml容量瓶中.随后进行叶绿素含量测定，用容量瓶中的提取液冲洗三遍光径为10mm的石英比色皿后，再将提取液倒入10mm石英比色皿3/4体积处，利用紫外可见分光光度计仪器测定波长为645、663nm处的吸光度并记录，将吸光度根据Arnon公式[6]，得出叶绿素a、叶绿素b和叶绿素的总含量.

1.4.2 光稳定性试验

待上述浸提试验测定完成后，将不同处理提取液在室温下曝光放置5小时，再次测定波长为645、663nm处的吸光度[7]，通过计算，探究叶绿素含量在不同处理提取液中的光稳定性.

1.5 数据处理

用EXCEL2010记录数据并绘制表格和折线图;用DPS7.05进行单因素方差分析得出叶绿素含量变化值，制作出折线图[8].

Arnon公式如下：

Ca=（12.7A633nm-2.69A645nm）×V/（1000W）， （2-1）

Cb=（22.9A645nm-4.68A663nm）×V/（1000W）， （2-2）

C总=Ca+Cb，  （2-3）

式中：A663nm、A645nm表示波长为663和645nm处的吸光度值;V为不同处理提取液体积（ml）;W为铁线莲“亲爱的”叶片鲜重（g），Ca、Cb的单位为（mg/g）.

2 结果与分析

2.1 叶绿素含量

不同提取液因体积比不同对铁线莲“亲爱的”叶绿素提取效果不同，用紫外可见分光光度计测定叶绿素的含量进行相关分析，结果如表3-1所示.由表3-1可以看出，不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”中叶绿素含量的提取效果是有差异的.从单一试剂提取液来看，处理2提取效果高于处理1，其中在叶绿素a和叶绿素总含量中存在显著差异，处理1、处理2提取的含量分别是0.095、1.352mg/g和1.463、1.947mg/g;叶绿素b含量相近，差异较小.从混合试剂提取液来看，处理3、处理4和处理5有明显差异.其中处理3中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量均为最高，分别是2.168、0.833、3.001 mg/g，处理5叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量均为最低.依5个处理来看，采用处理3提取液提取的叶绿素含量最高，提取效果最佳;处理1提取的叶绿素含量最低，效果最差.

根据公式计算的不同提取液中叶绿素含量变化值绘制的折线图（图3-1）.由图可以明显看出，不同处理提取液提取的叶绿素a含量远远高于叶绿素b含量，处理3叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量均为最高.从变化趋势来看，3条折线变化趋势相同，其中以叶绿素b含量波动幅度最小，叶绿素总含量波动最大，说明铁线莲“亲爱的”叶绿素b含量提取效果受不同处理提取液影响最小、叶绿素总含量影响最大，进而得知决定铁线莲“亲爱的”叶片叶绿素总含量的高低主要是来自于叶片叶绿素a含量.

结合表3-1和图3-1，处理1、处理2提取叶绿素含量均没有处理3、处理4和处理5叶绿素含量高，表明当丙酮、乙醇试剂单独使用时提取铁线莲“亲爱的”中叶绿素效果没有将两种试剂混合使用时提取效果好，可能是乙醇和丙酮试剂混合提取液对叶绿素的提取有协同效应，能够快速提取叶绿素.

2.2 浸提后曝光5小时叶绿素含量

浸提试验后提取液在室温下曝光5小时，分别测定提取液中铁线莲“亲爱的”叶绿素的含量，得出表3-2结果.将浸提后的叶绿素含量和浸提后曝光5小时后的叶绿素含量进行比较，结果图3-2所示.根据表3-2可知，不同处理提取液中叶绿素含量存在显著差异.根据叶绿素a含量可知，处理3中含量最高，为1.882mg/g;其次是含量差不多的处理2和处理4，处理1中含量最少，为0.414mg/g.根据叶绿素b含量可知，5个处理之间差异不是非常显著，均在0.800mg/g以下.根据叶绿素总含量可知，处理3含量最高，为2.617mg/g.说明浸提后室温曝光5小时对于铁线莲“亲爱的”叶绿素含量影响不大，结果和浸提后结果一致.

从图3-2折线得知，浸提后室温曝光5小时的提取液中叶绿素含量有所降低，可能是因为叶绿素性质不稳定，见光易分解.还可以看出，叶绿素b含量几乎无变化，说明不同提取液对叶绿素b含量影响较小;从叶绿素a含量看，处理1变化最大，处理2变化最小;从叶绿素b含量看，处理3变化最大，处理2和处理5几乎无变化;从叶绿素总含量看，处理1变化最大，处理2变化最小.所以可以得知在光照5小时的影响下，处理2叶绿素含量变化趋势最小，受光照影响最小.

2.3 叶绿素光稳定性

将不同提取液浸提测定的叶绿素含量和浸提后室温曝光5小时测定的叶绿素含量差值进行计算比较分析，得出如表3-3的结果.将差值变化转换成折线图表达，结果如图3-3所示.

从表3-3可以看出，经过5h曝光后，不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”的叶绿素稳定性影响并不是很大，均在1（mg/g）以下.从叶绿素a含量看，处理1和处理5含量相近且高，分别为0.532mg/g、0.528mg/g，处理2含量最少为0.140mg/g;从叶绿素b含量结果看，处理3最高，处理2最低;叶绿素总含量中仍是处理1和处理5含量相近且最高，处理2含量最低.从单一试剂提取液看，处理1和处理2叶绿素含量差异明显，均为处理2含量低;从混合试剂提取液来看，处理3中叶绿素a、叶绿素总含量最低，处理5叶绿素b含量最低.

从图3-3可明显看出，5个不同处理提取液中叶绿素b含量变化最小，其次是叶绿素a含量变化，叶绿素总含量变化最大，主要是因为叶绿素总含量为叶绿素a和叶绿素b之和.同时还可以得知，叶绿素b光稳定性好且高于叶绿素a光稳定性.从图中还可以看出，处理2含量变化值最低，说明处理2提取液稳定性最好;其次为处理3，处理1和处理5变化值相近且高.

3 讨论与结论

不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量提取效果的影响结果表明，混合试剂提取液提取的叶绿素含量高于单一试剂提取液提取的叶绿素含量，以丙酮：无水乙醇=1：1提取液提取效果最好，与其他处理提取液之间存在明显差异.得出丙酮和乙醇试剂混合对于叶绿素的提取有协同作用，能够有效提高叶绿素的提取效果.浸提后室温曝光5小时不同处理提取液铁线蓮“亲爱的”叶绿素含量结果表明，丙酮：无水乙醇=1：1体积比时提取液中所含叶绿素含量最高，95%乙醇提取液中叶绿素含量变化值最小，说明单一试剂95%乙醇提取液受光影响小，稳定性好.

铁线莲“亲爱的”叶绿素光稳定性比较结果表明，叶绿素性质不稳定，见光易分解;叶绿素b的光稳定性高于叶绿素a的光稳定性.单一试剂95%乙醇提取液光稳定性最好;混合试剂丙酮：无水乙醇=1：1提取液光稳定性最好，这与向芬等人研究的茶树叶绿素[8]结果一致.关于叶绿素提取方法一直是研究的重点，不同研究植物所采用测定叶绿素含量的方法不同，同一研究植物叶片不同阶段、不同位置叶绿素含量也有所差别.通过各种提取溶液提取，进行一系列操作来测定叶绿素含量，可能会有一定的误差.综上所述，丙酮：无水乙醇=1：1体积比的提取液为铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定的最佳试剂，提取效果最好且光稳定性较好.应注意的是，叶绿素在光下性质不稳定，在进行铁线莲“亲爱的”叶绿素提取、含量测定和保存情况时，适当做避光处理.

参考文献：

〔1〕GaoLulu，MaYuzhu，WangPeng，WangShu'an，YangRutong，WangQing，LiLinfang，LiYa. Transcriptome Profilingof Clematis apiifolia： Insights into Heat-Stress Responses.[J]. DNA and cell biology，2017，36（11）.

〔2〕牟建梅，张国芹，刘凤军.白菜叶绿素含量的测定方法筛选[J].江苏农业科学，2014，42（09）：289-290.

〔3〕万修志.提取测定淡水藻中叶绿素a的方法研究[D].山东建筑大学，2011.

〔4〕潘静，韩蕾.葡萄叶片叶绿素含量测定方法比较[J].西北园艺（综合），2017，17（06）：58-60.

〔5〕李继兰.猕猴桃贮藏中叶绿素降解机理及加工中影响其稳定性因素研究[D].西北农林科技大学，2008.

〔6〕张怀斌.叶绿素的光学性质及其应用[D].山东师范大学，2008.

〔7〕余伟军.铁线莲遗传多样性、杂交育种及离体快繁研究[D].福建农林大学，2017.

〔8〕向芬，李维，刘红艳，周凌云，丁玎，曾振.茶树叶绿素测定方法的比较研究[J].茶叶通讯，2016，43（04）：37-40.