基于网络药理学探讨淫羊藿抗创伤后应激性障碍的作用机制研究

仇志坤,马建春,吴红卫,陈永,杨泽民,陈吉生,刘志挺

(1.广东药科大学附属第一医院临床药学科，广东 广州 510080; 2.广东药科大学，广东 广州 510006)

创伤后应激性障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)是一种当个体经历严重创伤或者威胁情况后所产生的具有持续存在的精神性障碍[1-2]。随着近年来出现的自然灾害爆发、战争、暴力冲突等突发事件的增多，PTSD的发病有增多的趋势[3-4]。PTSD患者的症状主要有对创伤相关线索和事件的病理性重现和回避，并可能伴有选择性的遗忘和持续性的高唤醒。该精神障碍对社会和个人均造成沉重的负担，其具有慢性化、病程长、群体发病率高和临床疗效不足等特点[5-6]。因此，PTSD患者的生活质量和防治备受关注。研究显示神经递质水平、炎症因子调节的紊乱或神经类固醇水平等内分泌信号通路的紊乱可能是PTSD的发病起因[7-8]。这些生物功能的变化可能导致患者大脑出现功能的异常，比如闯入性再体现或过度警觉等，往往与临床上PTSD的症状密切关联。

鉴于PTSD发病机制的复杂性和多变性，临床上尚缺乏其特异性药物。部分抗精神病药物，如抗抑郁药中的5羟色胺再摄取抑制剂 (selective serotonin reuptake inhibitor,SSRIs) 是临床上用于防治PTSD的常用药物，代表药物有帕罗西汀和舍曲林[9-10]。其作用机制是通过调节PTSD患者中脑区中5羟色胺水平产生抗PTSD的药理效应。然而，该类药物的抗PTSD药效仅属于扩大适应症治疗，且临床应用价值尚未确切。同时，SSRIs在临床上防治PTSD须慎重考虑，其原因是该类药物起效慢，有效率不高，且可导致使用者患有自杀等毒副作用[11-12]。据此，继续深挖PTSD的发病机制，对寻找高效和低毒的抗PTSD药物具有研究意义。

由于临床上应用抗PTSD药物所存在的不足，中药在该防治领域的应用也越来越受到关注。淫羊藿 (epimedium) 又称三枝九叶草或仙灵脾，是一种多年生草本植物。中医记载其味甘、辛、温、归肾、肝经，具有祛风除湿、强筋骨和补肾壮阳的功效[13-14]。药理学研究显示淫羊藿具有抗骨质疏松、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗氧化、调节内分泌系统等作用[15-16]。近年来，淫羊藿在防治神经精神障碍中的研究备受关注。研究显示淫羊藿具有抗抑郁、抗应激、改善脑供血等药理效应[15,17-18]。然而，尚未有报道关于淫羊藿防治PTSD的作用。

PTSD与机体受到应激后产生情绪变化密切相关[18]。从中医辩证的角度进行分析，PTSD的致病与内因密切相关。内因方面主要是素体禀赋不足而致脏腑功能失调，病机与肾阳不足和肝气郁结相关。机体长期处于惊恐失调状态，惊则气乱、遍生诸症；恐则气下，肾精肾气受损，不得主生殖发育和封藏。《神农本草经》提及淫羊藿具有“强志”的功效，可治“中年健忘，老人昏耄”。《医学入门》则叙述淫羊藿可补肾虚和助阳，同时，淫羊藿的功效如同太阳，可补命门之火[19-21]。结合上述淫羊藿在防治神经精神障碍中的作用，推测淫羊藿可能具有抗PTSD效应。

目前，中药的研究已逐步从单一成分或靶点的研究模式逐步转向为多种活性成分和网络靶点映射的研究新模式。其代表的研究方法网络药理学为中医药从经验医学逐步转变为循证药学或精准药学的新途径[22-23]。本研究尝试采用网络药理学的分析方法，通过药物-活性成分-靶点-疾病构建网络，并结合相关靶点基因本体 (gene ontology,GO) 生物学分子功能分析和京都基因与基因组百科全书 (kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 基因作用信号通路富集分析探讨淫羊藿有效成分的潜在作用靶点、作用信号通路及生物分子功能等信息，多角度推测其防治PTSD的机制和可行性。

1 方法

1.1 淫羊藿活性成分和作用靶点筛选

淫羊藿活性成分和作用靶点的筛选主要是通过文献[24-26]和的经典数据库数据收集得到。研究采用中药数据库为Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP,http:∥tcmspw.com/) 和A Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine(BATMAN-TCM,http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。以“淫羊藿”为搜索关键词，得到淫羊藿的候选成分。进一步以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug-like,DL)为筛选参数，得到淫羊藿较高活性的成分。根据文献报道，2个参数的筛选条件为：OB≥30%和DL≥0.18[27]。

筛选活性成分后，在数据库中获取活性成分对应的靶点蛋白，并在蛋白质数据库UniProt (http:∥www.uniprot.org/uploadlists/) 标准化基因名称。Cytoscape3.7.2构建淫羊藿活性成分-靶点基因网络关系图。在输出结果中，以不同颜色的节点分别表示淫羊藿活性成分和靶点基因。两者通过连线相连表示其相关性，并展开拓扑学属性分析。

1.2 PTSD致病相关基因信息收集

PTSD致病相关基因信息收集也是主要通过常用数据库数据收集。研究通过经典数据库为Genecards (https:∥www.genecards.org) 和 Thera-peutic Target Database (TTD,https: ∥db.Idrblab.org/ttd/) 。以"post traumatic stress disorder”或"PTSD”为搜索关键词，得到PTSD发病相关蛋白信息。在数据库中获取对应蛋白信息后，通过UniProt数据库标准化基因名称。Cytoscape3.7.2构建PTSD-靶点基因的网络关系图，在输出结果中，以不同颜色的节点分别表示疾病和相关基因。两者通过连线相连表示其相关性，并进行拓扑学属性分析。

1.3 淫羊藿活性成分作用靶点与PTSD致病相关基因交集分析

在完成淫羊藿活性成分作用靶点和PTSD致病相关基因信息收集和筛选的基础上，研究尝试把淫羊藿活性成分作用靶点和PTSD致病相关基因取交集，得出淫羊藿抗PTSD药理效应可能的作用靶点基因。研究采用网络分析软件Venny2.1.0 (https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) 交集映射。通过输入相关基因，最终得到交集映射基因和韦恩图。

1.4 淫羊藿-活性成分-靶点基因-PTSD的关系网络构建

在完成淫羊藿活性成分作用靶点和PTSD致病相关基因交集映射基础上，尝试把淫羊藿-活性成分-交集靶点基因-PTSD等元素归集并构建关系网络，以探讨淫羊藿抗PTSD的作用机制。通过交集的基因，进一步筛选得到与PTSD致病相关的淫羊藿活性成分。继续采用Cytoscape3.7.2中绘制淫羊藿-活性成分-靶点基因-PTSD关系网络图。在完成可视化关系网络构建后，继续采用软件中“Network Analyzer”功能分析关系网络中的拓扑学属性。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)关系网络的构建

在构建淫羊藿-活性成分-靶点基因-PTSD的关系网络的基础上，研究进一步探讨这些靶点之间的相互作用和关系。实验将筛选的靶点导入STRING网络平台 (https:∥string-db.org/) 中构建靶点相互作用网络关系图 (protein-protein interaction,PPI)。把蛋白种类设置为“Homo sapiens”(即分析物种为人类)，根据STRING网络平台设定的参数，将评分条件 (置信度) 设定>0.4，采用R3.6.3软件和Cytoscape3.7.2对蛋白的自由度进行分析和统计，探讨淫羊藿防治PTSD的核心靶点的相互关系。

1.6 GO生物学分子功能富集分析

研究尝试探讨核心靶点基因富集的生物学分析功能，采用R语言3.6.3软件中的“clusterProfiler”、“DOSE”、“org.Hs.eg.db”、“stringi”等数据包在GO生物学分子功能方面进行富集分析和可视化处理，以P<0.05进行人类生物分子功能富集分析，并统计富集的结果。

1.7 KEGG基因作用信号通路富集分析

研究尝试通过KEGG分析探讨核心靶点基因富集的作用信号通路。根据文献的方法学提示，本研究采用R语言3.6.3软件中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“DOSE”、“stringi”等数据包在KEGG作用信号通路富集分析和可视化处理，以P<0.05进行人类作用信号通路富集分析，并统计富集的结果。

1.8 作用靶点富集信号通路图分析

选取KEGG分析中核心的富集信号通路进行分析，以探讨淫羊藿抗PTSD潜在的作用机制。实验采用R语言3.6.3软件中的“org.Hs.eg.db”、“pathview”、 “stringi”等数据包检索靶点基因作用在KEGG富集信号通路上的通路图，并将主要靶点基因在主要富集信号通路上标记，以图视化淫羊藿的药理效应是通过多靶点、多途径产生的。

2 结果

2.1 淫羊藿活性成分和作用靶点筛选结果

根据文献的检索，并结合TCMSP和BATMAN-TCM两个数据库的数据共收集到淫羊藿的成分144个。根据OB (≥30%) 和DL (≥0.18) 2个参数筛选，得到淫羊藿活性成分24个，结果如表1所示。这些活性成分中，主要有甾体类、苷类、黄酮醇类、黄酮类等化合物。在以上24个活性成分中，作用人类靶点蛋白的活性成分共21个，对应靶点基因188个，结果如图1所示。

表1 淫羊藿活性成分基本信息

Cytoscape3.7.2拓扑分析网络关系相关指标如下：节点209个，其中活性成分节点21个，相关靶点基因节点188个。网络密度0.018，网络集中度0.637，网络异质性为2.925，最短路径为43 472。最大自由度和介数中心度存在于活性成分quercetin，分别为136和0.709 107 06。

红色长方形：淫羊藿活性成分； 绿色八边形：靶点基因。

2.2 PTSD致病相关基因收集结果

根据数据库的检索，结合Genecards和TTD两个数据库的数据共收集人类PTSD致病相关基因210个，结果如图2所示。Cytoscape3.7.2拓扑分析显示网络相关指标如下：节点有211个，其中疾病节点1个，致病相关基因节点210个。网络集中度为1，网络密度为0.009，网络异质性为7.211，最短路径为44 310。最大自由度和介数中心度存在于疾病PTSD，分别为210和1。

2.3 淫羊藿活性成分作用靶点与PTSD致病相关基因交集结果

如图3显示，根据Venny2.1分析和统计结果，在淫羊藿活性成分作用靶点(188个)和PTSD致病相关基因(210)个中，交集映射的基因有30个。这些基因分别为：NOS2、ESR1、NR3C2、ACHE、SLC6A2、HMOX1、ADRB2、HTR3A、ADRA2B、SLC6A3、SLC6A4、DRD2、OPRM1、IL10、IL6、APP、IL2、IFNG、IL4、MAOB、FOS、SOD1、PRKCA、IL1B、CCL2、CXCL8、SERPINE1、IL1A、CRP、CXCL10。交集基因数目占总基因数目的8.2%。

绿色椭圆形： PTSD；蓝色六边形：致病相关基因。

图3 淫羊藿活性成分作用靶点与PTSD致病相关基因交集映射

2.4 淫羊藿-活性成分-靶点基因-PTSD的网络关系构建结果

淫羊藿-活性成分-靶点基因-PTSD的网络关系构建结果如图4所示。Cytoscape3.7.2拓扑分析网络中共有46个节点。其中药物节点1个，活性成分节点14个，靶点基因节点30个，疾病节点1个。其中关联边103条，节点平均自由度为4.478。网络集中度为0.593，网络密度为0.1，网络异质性为1.126，最短路径为2 070。关系网络中节点的度值和介值中心度是体现网络节点重要性的指标。图4显示节点的平均度值为4.478，大于该平均度值的节点有12个；节点平均介值中心度为0.028，大于该平均介值中心度的节点有12个。共有12个节点的度值和介值中心度均高于均值(见表2)，其中包括药物1个，疾病1个，活性成分6个，相关靶点基因11个。化合物分别为quercetin、C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)-、luteolin、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone、kaempferol、Anhydroicaritin。在这些化合物中，主要分类为黄酮类和苷类。靶点基因分别是ESR1、ACHE、NOS2、ADRB2。

绿色八边形：淫羊藿；蓝色六边形：活性成分；红色四边形：PTSD；黄色椭圆形：作用靶点。

2.5 PPI网络的构建结果

为探讨淫羊藿抗PTSD的潜在作用机制，研究将淫羊藿活性成分作用靶点基因和PTSD致病相关基因交集映射的30个靶点基因导入STRING数据库构建PPI网络。如图5A所示，该网络共有30个节点，相互作用关系194条，平均度值为12.9。将PPI网络数据导入R语言3.6.3软件中，蛋白的度数由高到低排序。筛选出大于平均度值的核心靶点蛋白18个，分别是IL-6、FOS、IL-1B、CXCL8、IL-10、CXCL10、CCL2、APP、SERPINE1、OPRM1、IL-4、HMOX1、IFNG、CRP、NOS2、IL-2、IL-1A、ACHE (图5B)。实验结果提示这18个靶点蛋白是PPI网络中的关键靶点，淫羊藿抗PTSD的潜在药理作用可能是通过作用于这些靶点得以发挥。

表2 淫羊藿-活性成分-作用靶点-PTSD网络关键节点及拓扑学特征

2.6 相关靶点基因GO生物学分子功能分析

根据前期分析，将淫羊藿活性成分靶点基因和PTSD致病相关基因中30个交集映射基因进行GO生物学分子功能分析。图6和图7显示筛选得与交集映射基因显著相关的生物学分子功能共42种(P<0.05)。其中，受到细胞因子的活性和受体的结合程度分子功能影响的基因数目各为33.33%。其次，生长因子受体的结合和铵离子的结合也是影响基因分子功能的重要因素，参与以上2种分子功能的基因数目分别为20%和16.67%。此外，也有部分基因参与到儿茶酚胺 (13.33%)、神经递质(13.33%)、生长因素 (13.33%) 的活性等生物分子功能的调节中。结果提示淫羊藿抗PTSD的潜在作用机制与多种生物分子功能有关，其中主要影响因素有细胞因子、受体结合活性、铵离子的结合，儿茶酚胺、神经递质、生长因素等。

2.7 KEGG作用信号通路富集分析结果

根据前期分析，将淫羊藿活性成分靶点基因和PTSD致病相关基因中30个交集映射基因进行KEGG作用信号通路富集分析。图8和图9显示筛选得与交集映射基因显著相关的作用信号通路共57条 (P<0.05)。从作用信号通路富集上分析主要与细胞因子与细胞因子受体的相互作用的信号通路 (34.48%) 和美国锥虫病相关信号通路 (34.48%) 相关。其次，白介素17和A型流感疾病相关信号通路也是重要的影响因素，在以上2种作用信号通路的相关基因的均为27.59%。此外，也有部分基因富集在炎症性肠病相关信号通路、百日咳相关信号通路、黑热病相关信号通路、类风湿性关节炎相关信号通路、阿米巴病相关信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路。富集在以上6种作用信号通路的相关基因的均为24.14%。结果提示相关基因共同参与调节信号通路较多，发挥抗炎、抗病毒、免疫调节等作用，可能是淫羊藿抗PTSD的潜在机制。

A. PPI网络图； B.度数排序。

图5淫羊藿抗PTSD发病相关靶点蛋白的PPI网络图和度数排序
Figure5PPI network diagram and degree ordering of target proteins of epimedium against PTSD

图6 GO生物分子功能分析Figure 6 GO analysis of biomolecular function

图7 GO生物分子功能分析 (基因比例)Figure 7 GO analysis of biomolecular function (gene ratio)

2.8 淫羊藿抗PTSD的作用信号通路图结果

结合图9和图10的实验结果，研究选取相关核心靶点基因主要富集的作用信号通路，如细胞因子受体的相互作用的富集信号通路 (图10)，美国锥虫病的富集信号通路 (图11) 和白介素17富集信号通路 (图12)。图中相关靶点基因已用红色所以标记。结果显示IL-2、IL-8、CXCL2、CXCL10等基因与细胞免疫和炎症调节作用密切相关。信号通路图结果提示淫羊藿抗PTSD的作用靶点可能是通过细胞免疫和炎症调节过程产生药效。

3 讨论

本研究主要探讨和推测淫羊藿抗PTSD的可行性和潜在的作用机制。文献检索和TCMSP和BATMAN-TCM数据库搜索和筛选得淫羊藿活性成分21个。目前，部分研究关于PTSD的致病与免疫系统功能的调节[28-29]。PTSD的发病可引起机体免疫功能调节的异常，但具体机制尚未完全清楚。近年研究表明，促炎性细胞因子水平的变化可能是PTSD潜在的发病机制之一[30-31]。PTSD患者免疫系统功能可产生异常，炎症反应增强，如患者血清中IL-6、IL-10和IL-1B等免疫因子的水平显著性提高[32-33]，提示PTSD患者可能存在免疫系统的激活，导致神经炎症的产生[30-33]。在恐惧记忆恢复后IL-6的释放可维持恐惧记忆。这些发现进一步加深对炎症因子在PTSD发病中作用，并提示IL-6和其他促炎细胞因子可能维持PTSD患者恐惧记忆，这并不能使恐惧记忆消失[34]。

图8 KEGG作用信号通路富集分析

图9 KEGG作用信号通路富集分析 (基因比例)Figure 9 KEGG analysis of action signal pathway concentration (gene ratio)

图10 淫羊藿活性成分在细胞因子受体的相互作用的富集信号通路中标注图Figure 10 Enrichment of the active components of epimedium on the interaction of cytokine receptor signaling pathways

图11 淫羊藿活性成分在美国锥虫病的富集信号通路中标注图Figure 11 Enrichment of the active components of epimedium in the American Chagas disease

图12 淫羊藿活性成分在白介素17的富集信号通路中标注图Figure 12 Enrichment of the active components of epimedium in the signaling pathway of interleukin 17

此外，文献也报道PTSD的致病与IL-1B的调节密切关联。如IL-1B中rs16944和rs1143633单核苷酸与PTSD的发病呈负相关。结果显示与对照组相比，PTSD患者的IL-1B中rs1143633*C和rs16944*A等位基因频率和携带率显著下降[35]。再者，细胞凋亡也参与PTSD的致病机理[36]。FOS蛋白被认为具有细胞增殖、分化和转化的调节作用[37]。FOS基因家族由以下蛋白组成，分别是FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2[38-39]。其相关的基因编码亮氨酸拉链蛋白，与Jun家族蛋白质构建二聚体，形成转录因子复合物AP-1[39]。因此，FOS基因/蛋白的表达与凋亡细胞死亡有关，已有报道FOS基因/蛋白的表达与PTSD的致病相关，与本研究中FOS蛋白作为PTSD发病的核心靶点蛋白一致。

进一步探索以上的靶点基因所富集的分子生物学功能和所在的富集信号通路，研究采用GO富集分析 和KEGG富集分析。实验结果提示细胞因子的活性和受体的结合程度的富集是核心靶点基因分子功能的主要影响因素。结合上述炎症因子在PTSD发病中的重要性，推测细胞因子中炎症因子及其与受体的结合程度是影响PTSD发病的关键，神经递质、生长因素、儿茶酚胺等生物因素也参与到PTSD的发病机制中。以上因素已有相关文献报道可从不同方面影响PTSD的病程进展，如神经递质中5羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺等水平的紊乱均是PTSD发病的重要影响因素[40-41]。在KEGG富集研究中，细胞因子之间受体的相互作用和白介素17通路是相关核心作用靶点主要富集的信号通路。这些信号通路富集多种炎症因子和趋化因子，并与其调控密切相关。其中在白介素17信号通路上富集的相关基因如AP-1、IL-4、IL-6、CXCL13等免疫相关的细胞因子，这些细胞因子成为影响白介素17信号通路上的重要因素，并影响PTSD的发病。本研究还发现在美国锥虫病的信号通路中多个相关基因与本研究中核心靶点相关，其中包括IL-10、IL-6等。这些基因均涉及免疫机体功能的调节。从GO富集分析和KEGG富集分析等研究的结果提示，淫羊藿抗PTSD的潜在药理效应与调节免疫系统中炎症因子的水平和表达关系密切。

本研究仅对网络数据挖掘的资料进行分析后推测淫羊藿抗PTSD的潜在作用机制，其意义在于给实验研究方向性。研究分析得涉及多种分子功能和多条作用通路。然而，以上结果尚需实验验证，如动物实验、分子生物学实验等。在研究淫羊藿抗PTSD效应中，动物实验可添加以上推测基因/蛋白的相关拮抗剂以验证该药理效应是否与所拮抗的基因/蛋白相关；在细胞水平探讨中，可上(下)调推测基因/蛋白以评价该药理效应是否与相应的基因/蛋白相关。据此，仍需通过相关的实验验证以上的推测。

综上，研究通过网络药理学的方法发现淫羊藿中多个活性成分可作用于同一靶点，单个活性成分也可以作用于多个靶点，并通过多条信号通路共同发挥药理效应。这体现出中药多成分、多靶点、多通路的整体调节作用特点。其活性成分能通过信号传导通路而起到抗PTSD的作用，对淫羊藿从基因蛋白层面推测其防治PTSD机制和可行性具有重要意义。