安顺市平坝区2020年春季散养户猪O型口蹄疫免疫抗体监测分析

班荣香

(贵州省安顺市平坝区动物疫病预防控制中心，贵州 平坝 561100)

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的1种急性、热性、高度接触性传染病，临床症状以蹄部水疱为典型特征，发病急，传播迅速。该病除通过感染的动物及排泄物传播外，还能以气溶胶的形式通过空气远距离传播。哺乳仔猪发病多呈急性胃肠炎和心肌炎，突然死亡，病死率可达100%[1]。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为15个A类动物疫病名单之首；我国也将其排在一类动物疫病的第1位，并规定所有生猪实行强制免疫[2，3]。平坝区用于免疫生猪的口蹄疫疫苗为O型口蹄疫合成肽疫苗，每年集中免疫时间为春、秋两季，平时采取随进随补的补免政策，最大限度保障平坝区生猪养殖业的健康发展。目前生猪散养户占平坝区生猪养殖总量的30%左右，在平坝区生猪养殖业中起着举足轻重的作用。

本次检测对平坝区9个乡镇送检的164份猪血清样品采用间接酶联免疫吸附试验(iELISA)，分析猪O型口蹄疫合成肽苗诱导产生的免疫抗体水平及免疫效果，为区域疫情预警、免疫防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗猪O型口蹄疫合成肽疫苗(多肽TC98+7309+TC07)，购自新疆天康生物技术股份有限公司(批号2019017)。

1.1.2 血清样品来源于平坝区9个乡镇82个村免疫猪O型口蹄疫合成肽疫苗的散养户生猪，免疫28 d后采集猪血清样品，每村采集2头份，共164份。

1.1.3 主要试剂猪O型口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体iELISA检测试剂盒，购自无锡优联生物科技有限公司(批号191010)。

1.1.4 主要仪器普通离心机(TG16B)、酶标仪(DNM-9606)、微型振荡器(PR-WZT-2)、恒温培养箱(PR-BYX-9082)。

1.2 方法

1.2.1 疫苗接种春防期间各村动物防疫员统一对辖区村寨的生猪散养户进行猪O型口蹄疫合成肽疫苗免疫，按照说明书进行猪耳根后肌肉注射，每头猪注射1 mL。平坝区动物疫病预防控制中心进行入村入户防疫督查，以确保防疫工作真实有效地开展。

1.2.2 血清样品采集免疫工作结束以后28 d，在乡镇畜牧兽医技术干部的指导下，各村动物防疫员参与，用一次性采血器随机到各村采集免疫生猪的全血样品，每村2头份。然后统一用普通离心机1 500 r/min 离心5 min分离血清，分装于1.5 mL EP管中，并在每份血清样品上标注样品信息编号。

1.2.3 血清免疫抗体检测按照猪O型口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体iELISA检测试剂盒说明书进行。(1)血清稀释：对照血清进行1∶4稀释，待检血清进行1∶40稀释。(2)洗涤抗原包被板：洗涤液按照1∶20倍稀释进行配制，根据检测样品数量取出对应的检测板条共计172孔，每孔加入稀释好的工作洗涤液200 μL，重复洗板2次，最后1次在吸水材料上拍干。(3)加阴性、阳性对照血清：阴性、阳性对照各设2孔，每孔加入对照血清100 μL。(4)加待检血清：每份待检血清样品设立1孔，每孔加入待检血清100 μL。(5)振匀：将反应板放置于微型振荡器上轻轻振荡混匀。(6)温育：反应板置37 ℃恒温培养箱温育30 min。(7)洗板：甩掉孔中的反应液，每孔加入稀释好的工作洗涤液 200 μL，重复洗板5次，最后1次在吸水材料上拍干。(8)加酶标二抗：每孔加入酶标二抗100 μL。(9)二次温育：反应板置37 ℃恒温培养箱中温育30 min。(10)再次洗板：甩掉孔中的反应液，每孔加入稀释好的工作洗涤液200 μL，重复洗板5次，最后1次在吸水材料上拍干。(11)加显色液：每孔先加入显色液A 50 μL，再加入显色液B 50 μL。(12)避光显色：轻轻振荡混匀后，置于室温下避光显色10 min。(13)加终止液：每孔加入终止液50 μL。(14)结果检测：在酶标仪上测定各孔D630 nm值。

试验过程中要注意几点：试验用的血清必须清亮无溶血；使用血清前最好置于离心机上进行瞬时离心，以避免打开血清管盖时有血清样品飞溅，造成不必要的污染；所有试剂及血清使用前应恢复至室温(20～25 ℃)；实验结束后所有试剂耗材进行无害化处理。

1.2.4 结果判定

1.2.4.1 结果的有效性判定成立条件：阳性对照与阴性对照平均D630 nm值之差>0.5(本次试验满足成立条件)。

1.2.4.2 检验结果计算S/P=样品D630 nm值/阳性对照平均D630 nm值

1.2.4.3 结果判定S/P≥0.20，样品免疫抗体判为合格；S/P<0.20，样品免疫抗体判为不合格。

2 结果

根据各样品检测结果：154份样品免疫抗体合格，合格率93.9%；10份样品免疫抗体不合格，不合格率6.1%(见表1、表2)。经计算样品D630 nm值离散度为0.947。

表1 各检测样品D630 nm值统计

表2 免疫抗体判定情况

3 结论与讨论

3.1试验结果显示，平坝区散养生猪O型口蹄疫VP1结构蛋白抗体合格率为93.9%，达到农业农村部规定≥70%的要求，说明O型口蹄疫合成肽苗能够诱导生猪产生较高水平的O型口蹄疫免疫抗体，具有较好的免疫保护力。

3.2检测样品D630 nm值离散度(0.947)较大，说明各个体之间、各个乡镇之间的免疫抗体参差不齐。由于实验室检测均为同一人操作，且试剂为同一厂家、同一批号，可排除实验室因素。分析抗体水平参差不齐的原因可能有以下几点：一是各乡镇防疫人员技术水平不一，免疫剂量、注射方法掌握不一致；二是生猪个体之间的差异，导致产生的抗体水平各有高低；三是各乡镇采集和保存血清情况不同，导致抗体水平不一[4]。

3.3目前我国对动物疫病防治采取“预防为主、防重于治”的原则，在临床上疫苗免疫作为预防疫病的首选[5]。近年来平坝区高度重视养殖业的发展，2020—2021年将大力实施建设年出栏40万头生猪产量、年屠宰加工生猪100万头的养殖生产项目。因此，生猪疫病的防控显得尤为重要，特别是对猪口蹄疫等烈性传染病更要加强防疫和净化。

3.4本次检测结果表明平坝区生猪使用O型口蹄疫合成肽苗免疫效果较好，建议以后继续使用该疫苗。为了取得更好的免疫效果，减少个体之间的免疫水平差异，在今后的防疫工作中要做到以下几点：一是从上至下要做好防疫实战培训，区疫控中心培训好乡镇技术干部，加强乡镇技术干部的理论知识和实践操作，乡镇技术干部再指导村级防疫员更好地开展防疫工作。二是各乡镇技术干部具体指导各村级防疫员时，一定要严格按照免疫规范和要求进行。三是村级防疫员在开展免疫工作的过程中要保证疫苗的免疫剂量、免疫部位准确，特别要按要求保护保存好疫苗，避免疫苗失效或效价降低。四是严格规范采样：用一次性采血管采血后，要在室温下倾斜放置；有离心机的放置30 min后置于离心机中经1 500～2 000 r/min离心5 min，分离血清；没有离心机的则在室温下倾斜放置2～4 h(放置过程中一定要防止阳光暴晒)，待血清自然析出[6]。五是保证送检血清样品的质量：血清要保证清亮无杂质、无溶血。一旦血液中的红细胞破裂产生溶血，将会影响血清中的抗体及检测效价。