一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

2020-10-29张喜懿温贵兰杨佰启张小波

贵州畜牧兽医 2020年5期

张喜懿，温贵兰*，陈广，田浪，杨佰启，张小波

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025； 2. 贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州贵阳 550016)

鸭疫里默氏杆菌病(或鸭疫里氏杆菌病)是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer， RA)引起鸭的1种接触传染性疾病，又称鸭传染性浆膜炎[1]。该病一年四季均有发生，不同品种的鸭均可感染发病，主要发生于1～8周龄的雏鸭，尤以2～3周龄的雏鸭最易感[2，3]。临床表现为眼鼻分泌物增多、呼吸急促、共济失调等症状，病理变化以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等为特征[4～6]。据相关文献报道，鸭疫里默氏杆菌至少有21个血清型，不同血清型之间交叉免疫保护性很低，疫苗效果较差；防控该病主要采用抗生素治疗，导致菌株产生较严重的耐药性[7～9]。2019年12月，贵州省黔东南州某养殖场送检1只49日龄病死花边鸭，通过病理剖检和细菌分离培养鉴定诊断为鸭疫里默氏杆菌感染。现将诊断情况报道如下，供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测病料无菌采集送检病死鸭的肝脏、心脏、脾脏作为检测病料。

1.1.2 主要试剂革兰氏染色剂、细菌药敏纸片、微量生化反应管(购自杭州微生物试剂有限责任公司)，2×EsTaqDNA Mix(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，DL 5 000 DNA Marker[购自宝生物工程(大连)有限公司]，配制培养基所用氯化钠、琼脂粉、胰蛋白胨、酵母粉(均购自索莱宝生物科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器电泳槽(DYCZ-HOB型)、电泳仪电源(DYCZ-8C型)(购自北京市六一仪器厂)，SYGENE电泳凝胶成像仪(购自GENE公司)，多功能梯度PCR仪(VeritiTm 96-Well Thermal Cycler)(购自ABI公司)，迷你离心机(MINI)(购自Scanspeed公司)，37 ℃隔水式电热恒温培养箱(BD53)(购自BINDER公司)，超净工作台(SW-CJ-2D/2G)(购自上海缔伦光学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检对送检病死鸭进行剖检，观察记录病变，无菌采集相关病料。

1.2.2 细菌分离培养及革兰氏染色镜检将采集的肝脏、心脏、脾脏病料分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基和鲜血琼脂培养基，分别于厌氧(5%CO2)与有氧条件下37 ℃培养12～16 h，观察菌落生长情况。挑取生长的单个菌落接种鲜血琼脂培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中进行纯培养。取纯培养物进行革兰氏染色，镜检。

1.2.3 生化试验无菌挑取纯培养的单个菌落接种于生化反应管中，于37 ℃培养24～48 h，观察并记录结果。

1.2.4 分离菌16S rRNA PCR检测及测序

1.2.4.1 引物信息细菌16S rRNA特异引物参考GenBank中的E05329菌株设计，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.4.2 PCR 检测及测序将纯培养的单个菌落加入5 μL灭菌ddH2O中，以此为模板进行细菌16S rRNA PCR检测。反应体系 50 μL：上、下游引物(10 mol/μL)各2.5 μL，2×EsTaqDNA Mix 25 μL，模板5 μL，ddH2O 15 μL。反应条件：94 ℃ 预变性 2 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检测。取目的基因胶条送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与GenBank中已有序列进行BLAST比对。

1.2.5 药敏试验选取27种药敏纸片通过 K-B 法测定分离菌株的耐药性，记录抑菌圈大小，参考美国临床和实验室标准化协会(CLSI)《抗微生物药物敏感性试验执行标准》(2016)判定药物敏感性。

2 结果

2.1 病理变化病死鸭心脏和肝脏均有纤维素性包膜(见图1、图2)；脾脏肿大，呈大理石样花纹(见图3)。

图1 心脏纤维素性包膜图2 肝脏纤维素性包膜图3 脾脏肿大，呈大理石样花纹

2.2 细菌分离培养及革兰氏染色镜检普通琼脂培养基和麦康凯培养基均未见菌落生长。鲜血琼脂培养基上生长出灰白色、圆形、半透明、不溶血的针尖状菌落，符合鸭疫里默氏杆菌的菌落特征(见图4)。取分离菌的纯培养物进行革兰氏染色镜检，可见单个或成双排列的革兰氏阴性小杆菌(见图5)。

图4 鲜血琼脂培养基菌落形态

图5 分离菌革兰氏染色镜检(1 000×)

2.3 生化试验分离菌株仅触酶和氧化酶反应为阳性。不发酵葡萄糖、乳糖和蔗糖，不利用枸橼酸盐，不还原硝酸盐，硫化氢、精氨酸、尿素酶反应为阴性，基本符合鸭疫里默氏杆菌的生化特性。

2.4 分离菌16S rRNA PCR检测及测序分离菌16S rRNA PCR产物凝胶电泳扩增出1 450 bp特异性条带，与预扩增片段相符(见图6)。测序结果显示分离菌16S rRNA 核苷酸序列长度为1 450 bp；通过GenBank中已有序列进行BLAST比对，与鸭疫里默氏杆菌GZ-RA1株的同源性高达99.8%。根据序列同源性≥99%可鉴定到种的标准，可鉴定分离菌为鸭疫里默氏杆菌，将此分离株命名为2019GZRA。

M：DL 5 000 DNA Marker； 1：分离菌； -：阴性对照图6 分离菌16S rRNA PCR检测结果

2.5 药敏试验分离菌株药敏试验结果显示对哌拉西林、头孢哌酮、米诺环素等8种药物敏感；对万古霉素、头孢拉定、红霉素、环丙沙星4种药物中度敏感；对氨苄西林、卡那霉素、丁胺卡那等15种药物耐药(见表2)。

表2 鸭疫里默氏杆菌2019GZRA株药敏试验结果

3 讨论

3.1鸭疫里默氏杆菌病与大肠杆菌病均可致鸭心脏、肝脏出现纤维素性包膜，脾脏肿大呈大理石花纹样[10]。为了鉴别大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌，本试验在进行细菌分离培养时分别接种了普通琼脂培养基、麦康凯培养基和鲜血琼脂培养基，前2种培养基均未见菌落生长，仅鲜血琼脂培养基上生长出灰白色、圆形、半透明、不溶血的针尖状菌落，初步排除了大肠杆菌感染。

3.216S rRNA具有高度的保守性和特异性，是快速、准确鉴定细菌的方法。本试验采用细菌16S rRNA特异引物对分离菌进行PCR扩增和序列同源性分析，确定为鸭疫里默氏杆菌。

3.3据有关文献报道，不同的鸭疫里默氏杆菌菌株对相同药物的敏感性不同[11，12]。本次共选取27种药物进行药敏试验，结果显示分离菌株2019GZRA对哌拉西林、头孢哌酮、米诺环素等8种药物敏感，与罗玲等[13]报道的对头孢类药物、氨苄西林高度敏感结果不一致；对氨苄西林、卡那霉素、丁胺卡那等15种药物耐药，耐药率为55.6%，比朱元军等[14]报道的对14种药物耐药更为严重。出现此种情况可能是细菌分离株的地域差异性所致，也可能是抗菌药物的长期大量使用导致鸭疫里默氏杆菌对多数药物产生了耐药性。建议该养殖场根据药敏试验结果使用敏感药物采取联合用药、穿梭用药、轮换用药的方法进行抗感染治疗，避免造成更大的经济损失。