基于UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析定心方Ⅳ号化学成分

任妍，陈嘉慧，张雅心，刘孟华，邹威，何盈，饶文婷，黄凯，周凤华

(1.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515； 2.南方医科大学药学院，广东 广州 510515； 3.湖南省妇幼保健院，湖南 长沙 410008)

《素问·痹论》中“脉者，血之府也，涩则心痛。”可见，冠心病是由于病邪久留于心以致瘀血，使得血行不畅、心脉失养，进而导致津痰凝结、气滞血瘀，最终心脉癥积而成[1]。针对冠心病瘀毒致变的基本病机，本课题组确立从心论治冠心病的治疗思想，选取南方医院临床效验方定心方(Dingxin Recipe，DXR)中主入心经的黄连、丹参、酸枣仁及灵芝四味药材，组成定心方Ⅳ号，共奏清热解毒、益气活血功效。动物实验发现，定心方Ⅳ号能有效调控动脉粥样硬化小鼠血脂水平，延缓斑块进展，但其发挥药效的成分不清楚[2]。因此，本研究采用灵敏准确的超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术，首次鉴定了定心方Ⅳ号的化学成分，寻找其发挥作用的药效物质基础，以期为后续药理机制研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290型高效液相色谱仪-6550Q/TOF-MS/MS(美国Agilent科技公司)；Qualitative Analysis质谱分析软件以及MassHunter 色谱工作站；EYELA N-1001型旋转蒸发仪(埃郎科技国际贸易上海有限公司)；BT25S型电子分析天平(广州计量检测技术研究院检定合格，编号20080775)及ELGA ClassicUV超纯水系统。

1.2 药材与试剂

丹参饮片(广西玉林有田药业有限公司，批号180701)；黄连片(广东大翔药业有限公司，识别号187HX18D01)；酸枣仁片(广东大翔药业有限公司，批号BJHX18F01)；灵芝片(广东大翔药业有限公司，批号187HX18D01)，饮片由南方医科大学中医药学院张宏伟教授鉴定。腺嘌呤(批号：A8626，质量分数>99%)、腺嘌呤核苷(批号：A9251，质量分数>99%)、原儿茶酸(批号：03930590，质量分数>97%)、原儿茶醛(批号：D108405，质量分数>96.5%)、咖啡酸(批号：C0625，质量分数>98%)、丹参酮ⅡA(批号：T4952，质量>98%)、丹酚酸A(批号：97599，质量分数>97.5%)、丹酚酸B(批号：SML0048，质量分数>98%)、丹参素(批号：SML0679，质量分数>98%)，均购买自默克生命科学(上海)有限公司。甲醇、甲酸均为分析纯(广州光华科技股份有限公司)，水为Millipore超纯水。

2 方法

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 采用ZORBAX Eclipse-C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)液相色谱柱；检测柱温为25 ℃；流动相由0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)组成，梯度洗脱(0～10 min，95%A；10～38 min，95%～0%A；38～40 min，0%A)；流速为0.5 mL/min；进样量为2 μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI源)，在正、负两种模式下进行扫描，分子量检测范围为50～1 000 D。干燥气体积流量：14 L/min，干燥气温度：250 ℃，雾化气压力：241 kPa，裂解电压：175 V，鞘气流量：11 L/min，鞘气温度：350 ℃，鞘气温度：65 V，毛细管电压：3 500 V，八级杆1射频电压：750 V，喷嘴电压：1 000 V，碰撞能量：20 V。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取丹参15 g、黄连15 g、酸枣仁20 g、灵芝10 g，浸泡1 h，再加400 mL水，煮1 h后使用旋转蒸发仪浓缩成质量浓度为1 g/mL的药液。

2.3 对照品溶液的制备

取腺嘌呤、腺嘌呤核苷、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、丹参酮ⅡA、丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素对照品适量，精密称定，加入甲醇配置成含各对照品质量浓度为0.5 μg/mL的混合对照品溶液。

3 结果

3.1 建立复方全成分数据库

在国内外数据库，包括CNKI数据库、Pubmed、ScienceDirect、Web of Science等检索丹参、黄连、酸枣仁、灵芝成分的有关文献，共总结出707种复方中药材的化学成分，其中包括275种灵芝化学成分，254种丹参化学成分，148种黄连化学成分及30种酸枣仁化学成分；建立包含化合物名称、结构式、分子式、精确分子量的复方成分数据库。

3.2 化合物鉴定

采用UPLC-Q-TQF-MS/MS技术，依据“2.1”项下条件检测供试品溶液，根据保留时间的先后顺序对复方中化学成分的质谱数据进行采集，得到正、负离子模式的总离子流图(TIC)，结果见图1。根据已建立数据库及文献信息，采用对照品对照、各化合物的精确质荷比、保留时间、二级碎片裂解离子并结合文献对定心方Ⅳ号的化学成分进行进一步确证，最终在定心方Ⅳ号的供试品溶液总离子流图中鉴别出54个化合物，包括14个酚酸类化合物、10个生物碱类化合物、8个萜类化合物、6个苯丙醇类化合物、5个黄酮类化合物和11个其他类化合物，其他类化合物包括氨基酸类、嘌呤类及木脂素类等。误差值小于8×10-6，具体保留时间、分子式、理论值、主要碎片及药材归属情况等见表1。各成分的药材归属情况依据文献及课题组前期的单味药材液质结果进行判断，并依据对照品与文献对化合物进行指认及鉴定。

图1 定心方Ⅳ号供试品的正离子模式(A)与负离子模式(B)TIC图Figure 1 The total ion chromatogram (TIC) of positive ion mode (A) and negative ion mode (B) of DXR IV

表1 定心方Ⅳ号中的化合物鉴定Table 1 Identification of chemical constituents from DXR IV

表1 (续)

3.3 复方水提液中主要化学成分的质谱裂解规律解析

3.3.1 酚酸类化合物 共鉴定出14个酚酸类化合物，包括丹参素(峰7)、原儿茶酸(峰8)、原儿茶醛(峰12)、咖啡酸(峰14)、绿原酸(峰15)、阿魏酸(峰18)、异阿魏酸(峰24)、丹酚酸F(峰25)、丹酚酸T(峰32)、丹酚酸D(峰39)、紫草酸(峰40)、迷迭香酸(峰42)、丹酚酸B(峰43)及丹酚酸A(峰46)，其中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A经对照品对照确认。没有对照品的化合物采用准确分子量和碎片裂解规律确定。丹酚酸类化合物是该处方中的特色化合物，主要来源于药材丹参。在多级碎裂中，丹酚酸类化合物以丹参素基的丢失和CO及H2O的丢失较为明显[48]。峰46的准分子离子峰为m/z493.114 0[M-H]-，二级质谱碎片离子为313.070 9[M-H-C9H8O4]-及295.061 0[M-H-C9H10O5]-，经对照品及文献[41]对比后确认为丹酚酸A，可能裂解途径见图2。

3.3.2 二萜类 共鉴定出5个二萜类化合物，分别为化合物Tanshinol B(峰16)、tanshinaldehyde(峰48)、新隐丹参酮(峰52)、1,2,15,16-四氢丹参醌(峰53)及隐丹参酮(峰54)，均来自药材丹参，且以丹参酮类化合物为特色化合物。该类成分的MS分子离子峰多为基峰，常可见丢失1个或多个CO的碎片离子峰。在tR=38.707 min时，峰54给出的准分子离子峰[M+H]+为m/z297.1485，失去一分子CO与一分子水后生成二级质谱碎片离子m/z251.143 8，与文献[49]描述相符，故推测为隐丹参酮，可能的裂解途径见图3。

3.3.3 三萜类 共鉴别出3个三萜类化合物，包括Epoxyganoderiol B(峰47)、Betulonic acid(峰50)及灵芝酸Md(峰51)，该类成分主要来自灵芝及酸枣仁。峰50的准分子离子峰为m/z455.352 0[M+H]+，失去一分子CO与一分子水后生成二级质谱碎片离子m/z409.348 1，进一步裂解生成m/z369.279 0离子，结合文献[44]鉴定为Betulonic acid。

3.3.4 生物碱类 共鉴别出10个生物碱类化合物，包括乌药碱(峰17)、木兰碱(峰19)、Stecepharine(峰26)、小檗红碱(峰27)、黄连碱(峰28)、表小檗碱(峰29)、四氢小檗碱(峰31)、药根碱(峰33)、小檗碱(峰36)、巴马汀(峰37)，其中小檗碱(峰36)已经对照品对比确认。本处方中的生物碱类化合物来自药材黄连及酸枣仁，且以黄连为主要来源。该类化合物在正离子模式下均产生[M+H]+的母离子，易丢失CO、CH4等。在tR=22.525 min时，峰36给出的准分子离子峰[M+H]+为m/z336.123 0，失去一分子CH3后生成m/z321.099 0离子，进一步裂解生成二级质谱碎片离子292.096 6[M+H-CH4-CO]+，结合文献[50-51]及对照品确认为小檗碱，可能的裂解途径见图4。

图2 丹酚酸A(峰46)的裂解途径Figure 2 The fragmentation of Salvianolic acid A (Peak 46)

图3 峰54(隐丹参酮)可能的裂解途径Figure 3 The feasible fragmentation of Peak 54 (Cryptotanshinone)

3.3.5 黄酮类 共鉴定出5个黄酮类化合物，分别为Vicenin-II(峰23)、斯皮诺素(峰34)、当药素(峰38)、6‴-阿魏酰斯皮诺素(峰44)及烟花苷(峰45)，均来自于药材酸枣仁。本研究依据准确分子量及碎片裂解规律对此类化合物进行鉴别确认。在质谱条件下，该类化合物主要在C环发生RDA(Retro-Diels-Alder)裂解，生成A环和B环2个碎片离子，若其A环具有5,7-二羟基取代则易失去中性分子C3O2、C2H2O等[52]。峰34在负离子模式下可见准分子离子峰m/z607.166 8[M-H]-,首先从准分子离子峰上脱去C4H8O4生成m/z487.127 4离子，进而再脱去C2H4O2生成m/z427.103 5离子；结合文献[28]及特征碎片离子推测为斯皮诺素，裂解途径见图5。

图4 小檗碱(峰36)的裂解途径Figure 4 The fragmentation of Berberine(Peak 36)

图5 斯皮诺素(峰34)可能的裂解途径Figure 5 The feasible fragmentation of Spinosin (Peak 34)

3.3.6 苯丙醇类 共鉴定出6个苯丙醇类化合物，包括3-(3′4′-Dihydroxyphenyl)-(2R)-lactic acid-4′-O-β-d-glucopyranoside(峰9)、3-(3′4′-Hydroxy-phenyl)-(2R)-lactic acid(峰10)、Methyl-3-(4′-O-β-d-glucopyranosyl-3′4′-dihydroxyphenyl)-lactate(峰13)、5-O-Feruloylquinic acid(峰20)、4-O-Feruloylquinic acid(峰22)及Methyl 4-O-feruloylquicinate(峰35)。该类化合物均来自黄连，多含酚羟基及羧基，并结合文献[14]进行指认。峰22的准分子离子峰为m/z367.103 5[M-H]-，脱去C10H10O4生成m/z173.046 6离子，结合文献[24]推测为4-O-Feruloylquinic acid。

3.3.7 其他类 包括有机酸类、氨基酸类、嘌呤类、木脂素类等。3号峰给出准分子离子峰m/z191.019 7[M-H]-，二级质谱碎片离子为163.033 3[M-H-CO]-，结合结构式及文献[6]推测为枸橼酸。经对照品鉴定，分别鉴定出1号峰、5号峰为腺嘌呤与腺嘌呤核苷。

4 讨论

定心方Ⅳ号中的主要成分包括以丹酚酸A/B/D/E/F及丹参素为主的酚酸类化合物，以隐丹参酮、新隐丹参酮为主的二萜类化合物，以小檗碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱等为主的生物碱类化合物及以斯皮诺素与6‴-阿魏酰斯皮诺素为主的黄酮类化合物。研究证实，丹酚酸A可减少动脉血栓形成，抑制信号转导活化，下调极低密度脂蛋白受体，减轻血管内皮细胞损伤[53]；丹参素可通过抗氧化机制减轻血管内皮细胞损伤，发挥心血管保护作用[54]；小檗碱能抗血小板聚集，影响血栓形成，并降低实验大鼠血清与组织中甘油三酯含量，降低血清游离脂肪酸水平，改善大鼠脂代谢[55]。此外，在定心方Ⅳ号水提液中鉴定出了酸枣仁中活性最好的抗氧化组分即6‴-阿魏酰斯皮诺素，但研究显示其与斯皮诺素在总抗氧化能力反应中呈拮抗作用[56]，提示后续研究需进一步测定复方中各化学成分的含量，以便区分复方中实际发挥抗氧化作用的有效成分。本研究表明，定心方Ⅳ号水提液中包含多种可抗氧化、保护血管内皮细胞、减小血栓形成及改善脂代谢的化学成分，有利于抗动脉粥样硬化，该结果与动物实验结果相符。由此可见，定心方Ⅳ号清热解毒、益气活血的作用确有一定的现代药理基础。

值得注意的是，虽然各单味药材化学成分所组成的复方数据库中成分数量繁多，但实际指认出的成分仅有54种，可能由溶剂、药材品质、药材批次等原因所致。由于组成复方的药材成分较为复杂、所含同分异构体较多、部分成分可参考文献较少、无统一化合物名称等因素，使部分成分指认的可信程度受损。此外，各药材成分重叠度虽较小，能根据保留时间进行一定程度的区分，但仍然对探究定心方Ⅳ号的化学成分有所阻碍。在更进一步的研究中，应增加供试药材的批量，建立定量结构分析的结构鉴定方法，并对各成分进行定量分析。

综上，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，首次对定心方Ⅳ号水提液所含的化学成分进行了分析，较传统方法有更高的分离度及敏锐度，基本阐明了复方的组成成分，对定心方Ⅳ号水提液成分的研究与鉴定有一定价值，为进一步阐明定心方Ⅳ号的药效物质基础及药理作用研究提供参考。