猪粪发酵菌株的筛选、评价及发酵模式优化

夏昊钧，叶文杰，许崇翔，张晨慧，肖建中，郑 强

（丽水学院生态学院，浙江丽水323000）

随着人民生活水平的不断提高，人们对猪肉及其肉制品的需求不断升高[1]。联合国粮农组织（FAO）资料显示[2]，到2050年全世界对肉类的需求量将增加73%，因此养殖规模也将随着肉类需求量的增加而不断扩大，同时导致猪粪的产量也随之增大。但目前规模化的养猪场大部分没有配套设置相对应的粪污处理设施[3]，从而造成严重的粪污生态污染。发酵床养殖模式是近年来备受关注的一种新模式，由于其不仅具有效率高、成本低、易于推广的优点，还能将粪污转化为有机肥资源，因此得到了各级地方政府的大力推广[4]。据统计，截至2017年10月，仅浙江省采用发酵床处理模式的养殖场就达到了323个[4]。

维持发酵床模式稳定运行的关键因素之一在于所投加的菌株。投加的菌株在发酵过程中利用猪粪中的营养维持生长并抑制臭气物质的转化、合成及释放，从而起到除臭的作用。猪粪发酵过程中的臭气物质数量众多，其中以氨气（NH3）与硫化氢（H2S）最具代表性，因此本研究结合嗅辨法初筛及氨氮降解复筛实验，从实验室保存菌种中筛选出具有高效利用氨氮潜力的菌株，并对其在发酵过程中对两种臭气物质释放量的抑制效果做出评价，为发酵床菌种的开发提供参考。

此外，进一步对基于气泡石的发酵模式进行了初步探索。传统的发酵床模式往往采用机械翻耕的方式来提高发酵床中的含氧量，促进发酵优势菌的生长，但机械翻耕不仅能耗巨大，且翻耕的过程会导致发酵床体热量的损失，而维持较高的温度对于杀灭猪粪中的虫卵以及加速猪粪的腐熟都具有重要的作用。因此，采用气泡石作为发酵床体的基底，从床底均匀通入空气，理论上能够达到提高床体含氧量与维持床体温度两者间的平衡。实验表明，基于气泡石的发酵模式能够进一步降低两种臭气物质的释放量。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

氨标准储备试剂、硫化氢标准储备试剂、紫外分光光度计、台式高速离心机、立式压力蒸汽灭菌器、牛肉膏蛋白胨、PDA、高氏1号、LB等培养基[5]。

1.2 菌种的筛选

1.2.1 菌种的初筛

此次菌种初筛采用六级分类法来测定臭味指标[6]。具体为：无臭味（0）；勉强感到臭味（1）；微弱的臭味（2）；明显的臭味（3）；很强的臭味（4）；难以忍受的臭味（5）。

1.2.2 菌种的复筛

利用氨选择培养基进行除臭菌种的初筛；绘制氨氮的标准曲线，再通过测定复筛培养基中氨氮的浓度筛选出除臭效果好的菌株。氨氮降解率计算：氨氮降解率（%）=（初始浓度-过段时间后浓度）÷初始浓度×100%。

1.3 NH3和H2S的测定

1.3.1 NH3的测定

在装有4 kg猪粪的大桶中放入装有200 mL2%硼酸溶液的大烧杯，用于吸收NH3，再用桶盖密封，每隔3 d用硼酸吸收凯氏法[7]测定NH3的释放量，以21 d为一周期。

1.3.2 H2S的测定

在装有4 kg猪粪的大桶中放入装有200 mL锌胺络盐溶液的大烧杯，用于吸收H2S，再用桶盖密封，每隔3 d用锌胺络盐吸收比色法[8]测定H2S的释放量，以21 d为一周期。

2 结果

2.1 除臭菌的筛选

2.1.1 除臭菌的初筛[9]

通过嗅辨法，在66个菌中共筛选出16株菌可视为有效菌（臭味等级为0、1、2），根据表1可知这16株菌分别是：活力 Z1、发酵 Z1、蚯蚓 Z2、发酵 X1、高温 Z1、高温 Z2、高温 Z3、有机 Z2、有机 Z3、地衣 X1、枯草 X1、有机 X1、猪粪 F2、秸秆 F2、发酵 Z1、凝结 X1。

表1 嗅辨法结果

对样品涂布、分离后得到66个菌株的初步定性筛选结果。采用以氨气为唯一氮源的培养基进行培养，从而初步筛选出能以氨气作为氮源的菌种。能利用氨气的菌种均会在初筛培养基中长菌或出现浑浊（生长情况用“+”表示），与不长菌、空白组（生长情况用“-”表示）存在明显的差异。由表2可以看出：能以氨气作为氮源的除臭菌株共50株，其中真菌20株、细菌12株、放线菌18株。细菌、真菌、放线菌这3种菌种的筛选比例分别为18.18%、30.30%、27.27%。

表2 不同菌株对NH3利用情况

两种初筛方法共有的菌包括：活力Z1、发酵Z1、蚯蚓Z2、发酵X1、高温Z1、高温Z2、高温Z3、有机Z2、有机Z3、地衣X1、枯草X1、有机X1、猪粪F2、秸秆F2，共14种。初筛的这14株菌不仅具有利用氨气的潜在能力，还具备较好的除臭能力。

2.1.2 除臭菌的复筛[10]

筛选以氨作为氮源的除臭菌通常使用氨选择初筛培养基[11]，选择30℃氨氮降解率在60%以上、50℃氨氮降解率在25%以上的菌种为复筛得到的菌种。由图1可知：有机Z2、有机Z3、高温Z1、高温Z3、地衣X1及发酵Z1这6株菌30℃和50℃氨氮降解率都低于筛选要求，秸秆F2、蚯蚓Z2、发酵X1的30℃氨氮降解率低于筛选要求，活力Z1的50℃氨氮降解率低于筛选要求。其中：枯草X1、有机X1、高温Z2和猪粪F2的降解作用明显；高温Z2菌株在整个过程中降解作用明显。总体来看，各菌株在接种复筛培养基后，在30℃下氨氮浓度呈快速下降趋势，而在50℃下氨氮浓度的下降趋势较为平缓。

图1 在不同温度下各菌种发酵的氨氮浓度

2.1.3 除臭评价

在除臭评价实验中，由图2和图3可知：4株菌的NH3累积释放量均低于空白对照组，说明4株菌对NH3除臭均有明显效果。4株菌的NH3释放量减少范围为10.18%～51.22%，其中效果最好的为枯草X1，其NH3释放量减少51.22%。除臭菌株中猪粪F2的NH3浓度变化趋势相较于其他3株菌株更为平缓，其最终的NH3释放量减少10.18%。枯草X1、猪粪F2的H2S累积释放量低于空白对照组，这2株菌对H2S除臭具有明显的效果，其最终的H2S释放量分别减少14.56%和19.63%。有机X1、高温Z2的H2S释放量高于空白对照组，这2株菌反倒增加了H2S的释放，可能原因是由于菌本身会产生H2S，增加了H2S浓度。

高温Z2对NH3除臭效果明显，但是其H2S释放量要高于空白对照组，猪粪F2对H2S除臭具有明显的效果，但是对NH3除臭效果不明显。除臭综合效果最好的组为枯草X1，其氨气和H2S释放量分别减少51.22%和14.53%。

图2 除臭菌NH3释放量曲线图

图3 除臭菌H2S释放量曲线图

2.2 填充物对猪粪发酵中NH3释放量的影响

猪粪自身含水量高且C/N低，在实践过程中可以选择合适的填充物来为微生物提供碳源，并增加堆体的孔隙度，使猪粪发酵过程中养分增多，抑制产臭气的菌，从而加速降解过程[12]。由图4和图5可知，各处理组NH3的释放量比对照低，说明填充物的添加对猪粪有一定的除臭效果，其表现在：改变和优化了猪粪内的C/N比例，增加了猪粪当中的C元素，使得C/N比增加，有利于菌的生长；此外增加了孔隙中的含氧量，抑制厌氧菌产生各种臭气，从而有效地减少了猪粪NH3的释放量；维持了湿度的平衡，较长时间维持猪粪当中的含水量。各处理组降解NH3的效果在前期较好，第9 d时除氨气效果最好的是椰丝，NH3的释放量减少90.97%；各处理组降解NH3的效果在后期变弱，猪粪堆肥发酵整个周期内除NH3效果最好的是谷壳，NH3的释放量减少86.48%。

图4 不同填充物对猪粪氨气的除臭滴定效果图

图5 填充物对猪粪发酵NH3释放量的影响曲线图

2.3 气泡石对猪粪发酵中NH3及H2S释放量的影响

随着科学技术的发展，发酵技术也在不断进步。在猪粪发酵过程中适当地通气能抑制臭气的产生[13]，气泡石通气具有保持温度、能耗低、连续通气等优点，促进猪粪降解。由图6和图7可以看出：在21 d的发酵过程中，两组NH3的释放量都较为平稳，气泡石组的NH3累积释放量明显少于空白对照组的NH3释放量，其NH3释放量减少64.09%。H2S的释放量在堆肥前期的0～15 d较多，在堆肥后期15～21 d内曲线趋于平缓，说明到后期猪粪中H2S释放量很少。两组的H2S累积释放量存在着明显的差别，对照组H2S累积释放量为0.545 mg/kg，气泡石组H2S累积释放量为0.419 mg/kg，其H2S释放量减少23.12%。

气泡石装置NH3和H2S累积释放量均低于空白对照组，说明了气泡石对猪粪的NH3和H2S有一定的除臭效果，其表现在：增加了猪粪发酵过程的含氧量，抑制厌氧菌产生各种臭气，从而有效地减少了猪粪发酵过程中NH3和H2S的释放量。

图6 气泡石NH3释放量曲线图

图7 气泡石H2S释放量曲线图

3 讨论

3.1 臭气来源及除臭效果评价

堆肥产生的臭气包括NH3、H2S和挥发性有机化合物等，其中NH3产生量较大[14-16]。黄旺州[17]研究显示，添加15%锯末的牛粪在降解过程中抑制了NH3释放（P＜0.01）。陈丽园等[18]在除臭菌株筛选方面做了相关研究，筛选得到的菌株使NH3和H2S的释放量降低67.95%和26.6%，抑制NH3释放效果较明显，但对H2S作用不明显。

3.2 发酵菌株的筛选方法

初筛实验上，臭气感官法首先被尝试，这种方法被很多人运用[19-20]，但是这种方法需要培训嗅辨员，在试验过程中发现嗅辨效果不明显，费时费力，于是又采用了氮源培养基选择法[21-22]，这两种方法结合的方式可以提高其准确率，相对于精细地测量NH3和H2S可以缩短其检测时间提高其实验效率。

3.3 基于气泡石模式的发酵床技术

沈玉君等人[13]通过实验发现持续通气NH3浓度最先降低至合理浓度，然而间断通气及不通气都要远大于这个时间。在此次研究气泡石对猪粪臭气影响的实验中也得出了相同结论。气泡石通气具有保持温度、能耗低、连续通气等优点，理论上能够在提高床体含氧量与维持床体温度两者间达到一个平衡，并最终体现在进一步减少臭气释放以及加速猪粪降解、腐熟上。关于气泡石发酵床模式与基于机械翻耕的传统发酵床模式在能耗成本、床体温度变化、猪粪腐熟程度等方面的比较，需要在猪场进行系统的实地评价。