UPLC-MS/MS测定鱼肉中4种硝基呋喃类药物代谢物残留量的方法研究

赖秀梅,李 亚，梁剑锋，卓梅芳，黄 盈

(1.梧州市食品药品检验所，广西 梧州 543000；2.梧州学院 化学工程与资源再利用学院，广西 梧州 543002)

硝基呋喃类兽药是在鱼类养殖中曾经使用的一种抗生素，其常用的有4种：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林[1-3]。硝基呋喃类药物进入鱼体后会代谢，其相对的代谢产物分别为3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-乙内酰(AHD)、氨基脲(SEM)，其由于与蛋白质结合而相当稳定，所以目前通过检测代谢物的残留量，反映硝基呋喃类药物的残留状况[4-7]。硝基呋喃类兽药由于价格较低且效果好，所以在畜禽及水产养殖业被广泛用来治疗鱼类由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等[8-10]。但是，研究发现硝基呋喃类药物及其代谢物，对人体有致癌、致畸胎等严重的副作用，所以现行法律法规均禁止硝基呋喃类药物在饲养过程中使用，并在动物性食品中不得检出，其相关限量见中华人民共和国农业农村部于2002-12-24发布的公告第235号及于2005-10-28发布的公告第560号[10-12]。国家卫生健康委员会也在2010-03-22将硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能违法添加的非食用物质黑名单。在农业农村部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中也规定动物源性食品不得检出硝基呋喃代谢物[13-15]。

虽然监管部门在2006年发生“多宝鱼兽药残留事件”后，对使用硝基呋喃类违禁兽药行为进行大力整治，但是从近年来水产品的国家食品安全抽检中，鱼中检出硝基呋喃类违禁兽药问题还是比较突出。2017年国家食品药品监督管理总局开展了经营环节重点水产品专项检查和抽样检验中，抽检鲜活水产品808批次，检出不合格样品69批次，其中硝基呋喃代谢物不合格21批次[16]，占不合格总数的30.4%。在2016年经营环节水产品专项检查基础上，国家食品药品监督管理总局在部分城市继续组织开展了经营环节鲜活水产品抽检监测，抽检鲜活水产品607批次，检出不合格样品66批次，硝基呋喃代谢物不合格样品16批次[17]，占不合格总数的24.2%。所以，从近年来国家食品安全监管部门对水产品的监督抽检来分析，鲜活水产品养殖过程中违规使用硝基呋喃等禁用药物的问题仍然比较突出。

目前检测肉类中兽药残留常见的方法主要有：高效液相色谱-串联质谱法[1-2,8,10,18-20]、液相色谱法[21-23]、常规理化检测法[24]、酶联免疫法[25-27]、毛细管电泳法[28]等。食品分析实验室主要采用国家标准GB/T 21311—2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱串联质谱法》、GB/T 20752—2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定》，这2个国标方法在样品处理时均需要将乙酸乙酯萃取液提取并吹干、转溶等实验步骤，且还需要将样品过固相萃取柱净化[29-30]，前处理步骤复杂，检验成本高，基质效应干扰大。本研究简化前处理操作，提高检测效率，建立准确、高效、快速的硝基呋喃代谢残留量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：市售鱼肉。

标准物质及内标：3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-乙内酰(AHD)、氨基脲(SEM)，纯度均大于99%,德国Dr.Ehrenstorfer公司；内标：AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SCA-HCl-13C,15N2，纯度均大于99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

试剂：甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；正己烷，色谱纯；甲酸，色谱纯；盐酸，分析纯；邻硝基苯甲醛，分析纯；磷酸，分析纯；氯化钠，分析纯；盐酸溶液0.2 mol/L；衍生剂：称取1.5 g邻硝基苯甲醛，用甲醇溶解并定容到100 ml，现配现用；磷酸钾溶液0.3 mol/L；氢氧化钠溶液2.0 mol/L。

1.2 仪器与设备

1.3 方法

1.3.1样品前处理

称取2.00 g均质鱼肉样品于50 ml离心管中，加入10 ml甲醇和水的混合溶剂(甲醇与水的体积比为1∶1)，漩涡10 min，在4 750 r/min的转速下离心5 min，弃去上清液得固体沉淀，加入10.0 ml盐酸溶液、100 μl邻硝基苯甲醛衍生剂，再涡旋10 min，置于37℃水浴振荡16 h。

在4 750 r/min的转速下离心5 min，取全部上清液于50 ml离心管中，加入10 ml盐酸溶液，2.0 ml磷酸钾缓冲液，加入1.0 ml氢氧化钠溶液，轻微摇匀，加入15 ml正己烷，摇匀，在5 000 r/min的转速下离心8 min。取下清液6.50 ml，到预先装有4.0 g氯化钠的离心管中，加入2.50 ml乙腈，上下振摇1 min，在5 000 r/min的转速下离心8 min，取上清液0.70 ml到2.0 ml离心管，再加入0.70 ml 0.1%甲酸水溶液，摇匀，15 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm滤膜，将滤液上机测试。

1.3.2液质条件

1.3.2.1液相条件

色谱柱为ACE UltraCore C18柱(2.1 mm×75 mm,2.5 μm)，柱温为35℃，流速0.35 ml/min，进样量1 μl，梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.2.2质谱条件

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离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子扫描(AJS ESI+)；检测方式为多反应监测(MRM)；毛细管电压3 500 V；定性离子对、定量离子对、碎裂电压以及碰撞能量见表2。

表2 硝基呋喃类兽药残留的代谢物多反应监测离子对及质谱的相关参数

1.3.3标准曲线绘制

准确配制0.1、0.4、0.8、1.6、2.0 ng/ml的混合标准溶液(含内标2 ng/ml)，经过1.3.1节中衍生化、提取后，从低浓度到高浓度依次进样分析，每个浓度的标准物质重复进样检测3次，所得到的峰面积与相应的内标峰面积的比值，与相对应的标准溶液浓度作标准曲线，得到相应线性回归方程与相关系数。

1.3.4方法灵敏度

将适量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM标准物质加入到空白鱼肉中，采用1.3.1节前处理方法处理后，用LC-MS/MS检测观察目标物质特征离子质量色谱峰信噪比(RS/N)和对应标准物质浓度，RS/N>3者定为方法的检测限。

1.3.5方法准确度和精密度

在空白的鱼肉中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg的标准物质后，然后按照上述方法进行水解衍生，提取净化后测定，内标法计算，进行验证方法的回收率实验，每个添加量进行5个样品平行实验，重复3次，同时采用国标GB/T 21311—2007、GB/T 20752—2006两个方法做加标回收实验。

1.4 实际样品检测

取阳性鱼肉样品(检出3-氨基-2-恶唑酮)，按照本试验方法进行提取检测，同时采用国标GB/T 21311—2007、GB/T 20752—2006检测。

2 结果与分析

2.1 提取液中盐酸浓度对目标分析物水解影响

分别采用0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L盐酸溶液对加标样品(添加0.8 μg/kg硝基呋喃类代谢物混合标准物)进行水解提取，其对应硝基呋喃4种代谢物的相对响应值见图1。在0.05 mol/L盐酸溶液时，样品中硝基呋喃类代谢物只有部分目标分析物水解，4种代谢物相对响应值比较低，随着盐酸浓度增加，目标分析水解相对响应值随之增大，在盐酸浓度0.2 mol/L时，目标分析物完全水解，相对响应值达到最大，盐酸浓度超过0.2 mol/L后，目标分析物的水解出现抑制，相对响应值出现了下降。所以试验方法中采用0.2 mol/L盐酸浓度对样品中目标分析物水解比较合适。

图1 不同盐酸浓度对鱼肉中硝基呋喃代谢物水解影响

2.2 标准曲线

按照上述标准溶液的浓度进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数见表3。硝基呋喃的代谢物AOZ、AMOZ、AHD、SEM在浓度0.1～2.0 ng/ml呈良好线性关系，相关系数(R2)均大于0.990。

表3 硝基呋喃类代谢物标准物质线性回归情况

2.3 方法的灵敏度

按照1.3节的方法进行处理，当添加浓度为0.5 μg/kg时，测定目标分析物AOZ、AMOZ、AHD、SEM的RS/N均大于3，该方法的检出限为0.5 μg/kg。0.5 μg/kg添加样品AOZ、AMOZ、AHD、SEM特征离子质量色谱图见图2。

图2 AOZ、AMOZ、AHD、SEM特征离子质量色谱图

2.4 方法精密度

在空白鱼肉中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg的标准物质进行回收率试验，同时对阳性鱼肉样品(检出AOZ)进行试验，采用本研究的检测方法与国标GB/T 21311—2007、GB/T 20752—2006两种方法进行比较，结果见表4～表6。

表4 鱼肉中硝基呋喃类代谢物添加回收率检测结果(n=5)

表5 国标方法加标回收率检测结果(n=5)

表6 3种方法对实际样品检测结果

由表4、表5可见，鱼肉中硝基呋喃类代谢物在0.5～5.0 μg/kg，平均回收率为94.3%～96.4%，相对标准偏差在3.0%～4.5%(n=5)。与国家标准GB/T 20752—2006、GB/T 21311—2007的方法加标回收试验相比较，本方法在回收率指标方面与国标方法相近，但在方法相对偏差指标上优于国标方法，这个可能与本方法减少了萃取液吹干转溶、过固相萃取净化柱等实验步骤有关，减少了样品的损失，提高了方法精密度。该方法试验结果符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》对回收率和精密度的要求[31]。在对实际的阳性样品(检出AOZ)检测中，本方法检测结果与2个国标方法检测结果进行比较，相对偏差均小于10%，符合标准要求。表明该方法对对鱼肉中硝基呋喃类代谢物(AOZ、AMOZ、AHD、SEM)残留提取、净化、检测是稳定的，具有良好的实验准确度和精密度。

3 讨论

鱼肉中硝基呋喃类代谢物国家检测标准GB/T 20752—2006、GB/T 21311—2007实用性比较好，但是存在方法重复性差、基质效应干扰大、检测步骤复杂、成本高等不足。本方法基于液质联用分析技术对鱼肉中硝基呋喃类代谢物(AOZ、AMOZ、AHD、SEM)残留进行测定，主要优化了前处理提取方法，简化操作步骤：检测过程中无需采用乙酸乙酯有机试剂萃取，无需将萃取液吹干转溶，样品提取液也无需要经过固相萃取柱净化。整个检测方法可以大幅降低劳动强度，缩减检测时间，减少成本，且重复性好、检出限低，能够同时检测鱼肉中4种兽药硝基呋喃类残留，为鱼肉中硝基呋喃类兽药代谢物的检测，提供了一个快速、简单、低成本的可行检测方法。该方法适合在大批量的农产品安全监督抽检中使用。