粮食中主要霉菌实时荧光PCR检测方法建立

冯优妍,杨爱馥,郑秋月,万 超,曹际娟，

(1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034； 2.大连海关，辽宁 大连 116001)

霉菌污染是粮食储藏过程中尤为重要的危害原因，尤其产毒霉菌污染更为严重地影响粮食质量安全。霉菌污染对粮食主要产生两大方面的危害[1]:一是会引起粮食发生变质，降低粮食的口感、营养等食用价值，带来经济上的巨大损失。二是霉菌毒素会危害人与动物，威胁人类的身体健康。如一部分黄曲霉和所有的寄生曲霉在其代谢过程中会产生黄曲霉毒素，黄曲霉毒素具有致畸、致癌、致突变的作用，危害也最为严重[2-4]。

本研究设计TaqMan®实时荧光PCR反应引物和探针，构建优化实时荧光PCR反应体系，建立引发粮食霉变的黄曲霉和寄生曲霉霉菌实时荧光PCR快速检测方法；并与行业标准SN/T 2582—2010中普通PCR法[5]进行了比较，结果表明,实时荧光PCR方法快速、简便、易于观察结果，为粮食霉变霉菌的早期快速准确鉴别提供了有效技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微生物DNA快速提取剂(lysis buffer for microorganism to direct PCR)、Premix Ex Taq(Takara Code:RR390A)、Rox Peference DyeⅡ；引物及探针由宝生物工程(大连)有限公司合成、试验菌株来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

表1 试验菌株及其编号

1.2 仪器与设备

Viia7荧光定量PCR仪，ABI公司；小型高速离心机，Eppendnorf公司；迷你离心机，Tomy公司；恒温水浴锅，Memmert公司；超微量紫外分光光度计，Eppendnorf公司。

1.3 引物与探针设计

根据黄曲霉和寄生曲霉共有的5.8SrDNA的ITS序列，应用Primer5.0软件设计通用引物和探针，并将设计好的引物和探针在GenBank上进行blast比对确定引物和探针的理论特异性。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物与探针序列见表2。

1.4 霉菌DNA的快速提取

(1)取50 μl微生物裂解缓冲液(lysis buffer for microorganism to direct)PCR 于灭菌的微型管(microtube)中。

(2)用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，置于微型管(microtube)中搅动几下后取出。需要注意的是：牙签置于微型管(microtube)中的时间不要过长，否则会影响裂解液的体积，并会影响PCR扩增效果。

(3)80℃热变性15 min后，低速离心，取1～5 μl裂解后的上清液作为PCR反应的模板。

1.5 实时荧光PCR检测方法的建立

优化反应体系和反应条件，得出最佳实时PCR通用反应体系和反应条件。

反应体系总体积为25 μl，其中Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl，探针(5 μmol/L)1 μl， Rox Peference DyeⅡ 0.5 μl，模板DNA(10～100 μg/ml)2 μl，灭菌双蒸水8 μl。

反应条件：95℃预变性10 s(1个循环)；95℃变性5 s，60℃退火/延伸34 s(40个循环)，荧光阈值为设备默认值。

1.6 特异性试验

利用1.4节中的DNA提取方法提取黄曲霉、寄生曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、正灰绿正青霉、白曲霉、赭曲霉和棒曲霉的DNA进行实时荧光 PCR扩增，对建立的实时荧光PCR检测方法进行特异性测试。

1.7 灵敏度试验

以黄曲霉CGMCC3.4408为参考菌株进行灵敏度试验，将菌株DNA提取液进行10倍梯度稀释，使DNA浓度为10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl，进行实时荧光PCR扩增，确定所建立的实时荧光PCR检测方法的灵敏度。

1.8 与SN/T 2582—2010中普通PCR方法比较

以平板计数方式为基准，比较实时荧光PCR方法与SN/T 2582—2010中普通PCR方法检测的灵敏度差异。

1.9 模拟污染样品检测

建立10个霉菌模拟污染粮食模型，分别将试验仓中的500 g粮食置于无菌环境中，用喷雾器向粮食表面均匀喷洒适量无菌水，混合均匀后用塑料薄膜密封，一周后分别采用GB 4789.16—2016[6]和实时荧光PCR方法进行霉菌检测。

2 结果与分析

2.1 特异性试验结果

特异性试验结果如图1所示。由图1可知，黄曲霉、寄生霉菌均检测到了特异性扩增曲线，实时PCR扩增结果均为阳性。其它常见霉菌菌株的检测结果均为阴性。

图1 粮食中主要霉菌特异性检测1.黑曲霉；2.杂色曲霉；3.正灰绿正青霉；4.白曲霉；5.黑曲霉；6.黄曲霉；7.黄曲霉；8.寄生曲霉；9.赭曲霉；10.棒曲霉

2.2 灵敏性试验结果

(1)将黄曲霉CGMCC3.4408菌株的DNA提取液进行10倍梯度稀释，以DNA浓度10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl为模板进行荧光PCR检测，灵敏度检测结果如图2所示，当DNA浓度≥10-2ng/μl时可发生特异扩增，说明黄曲霉CGMCC3.4408 DNA检测灵敏度可达到10-2ng/μl。

图2 黄曲霉实时PCR灵敏度检测1.10 ng/μl扩增曲线；2.1 ng/μl扩增曲线；3.10-1 ng/μl扩增曲线；4.10-2 ng/μl扩增曲线；5.10-3 ng/μl扩增曲线；6.空白对照。

(2)取50 μl已复苏的黄曲霉菌培养物，培养过夜后测其OD值，估计其菌数，然后按10-1、10-2、10-3CFU/ml，等倍数梯度稀释，取几个梯度的菌液进行平板计数，重复2次，取平均值确定其真实的菌密度。每个梯度菌液提取DNA，进行实时PCR检测，将检测结果与平板计数结果比较，结果如表3所示，荧光PCR检测灵敏度可达到76 CFU/ml。

表3 实时PCR与平板计数结果比较确定检测灵敏度

2.3 与SN/T 2582—2010中普通PCR方法比较

以灵敏度测试中黄曲霉菌标准菌株的DNA稀释液为模板，同时采用建立实时荧光PCR法和SN/T 2582—2010中普通PCR方法进行方法检出限比较。两种检测方法比较的结果如表4所示。

表4 实时荧光PCR法与SN/T 2582—2010中普通PCR法检测结果的比较 ng/μl

由表4可见，建立实时荧光PCR法可检测10-2ng/μl的霉菌，SN/T 2582—2010中普通PCR方法可检测10-1ng/μl霉菌。实时荧光PCR法检测霉菌的灵敏度比SN/T 2582—2010中普通PCR法高出一个数量级。

2.4 在霉变玉米样品检测中的应用

按照1.9节中的方法建立霉菌模拟污染粮食模型，用实时荧光PCR方法和GB 4789.16—2016方法同时检测污染模型中分离得到的霉菌。采用实时荧光PCR方法检测出2个样品中存在黄曲霉和寄生曲霉菌，分离得到的阳性菌株同时采用GB 4789.16—2016方法进行验证，确认分离菌株为黄曲霉和寄生曲霉菌。验证结果表明，建立实时荧光PCR方法鉴定霉菌准确度为100%，显示该方法具有较好的适用性。

3 讨论

本研究所建立的实时荧光PCR法可以特异性检测粮食中黄曲霉和寄生曲霉菌。目前，国内外粮食中主要霉菌检测仍以传统的病原菌培养和形态学、生化鉴定为主。霉菌培养和形态学鉴定耗时长，工作量大，且霉菌孢子容易造成实验室污染，霉菌鉴定需要实验室人员丰富的经验。本研究建立了粮食中黄曲霉和寄生曲霉实时荧光PCR快速检测方法,与SN/T 2582—2010中普通PCR法和传统培养鉴定法相比较，验证了实时荧光PCR方法的可靠性。与SN/T 2582—2010中普通PCR检测方法相比，实时荧光PCR检测的优势主要表现在：(1)高灵敏度：实时荧光PCR法可检测10-2ng/μl的霉菌，普通PCR方法可检测10-1ng/μl霉菌；(2)操作简便，速度快，实现PCR扩增和产物分析一体化；(3)安全、无污染，实时荧光PCR在全封闭状态下进行PCR扩增和产物分析，杜绝了SN/T 2582—2010中普通PCR开放检测对环境的污染和由此导致的假阳性[7-8]。建立方法为我国粮食霉变监测和快速检测提供新的技术手段，可以快速、灵敏、准确检测出粮食中是否带有霉菌，早期识别霉变和病害发生，有效控制霉变和霉菌毒素产生发展，可提高粮食制品预防霉变病害和霉菌毒素污染发生发展的监测水平。