雌二醇对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Wnt/β-catenin信号通路的影响

邱敏 翟书珩 付勤

中国医科大学附属盛京医院骨科，辽宁 沈阳 110004

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMO)是由于雌激素缺乏或水平下降，成骨细胞承担的骨形成和破骨细胞承担的骨吸收活动之间的平衡被打破，骨吸收超过了骨形成，从而引起骨量减少、骨组织显微结构退化，进而导致骨脆性增高、骨强度降低、骨折危险性增加的一种全身代谢性骨骼疾病[1-2]。PMO过程涉及多种细胞因子信号通路的调控[3]。近年来发现经典Wnt/β-catenin信号通路在骨形成过程中发挥重要作用，已成为骨质疏松领域的研究热点[4]。本研究通过观察雌二醇对去卵巢骨质疏松症大鼠Wnt/β-Catenin信号通路相关因子表达的影响，探讨雌二醇防治PMO的相关分子生物学机制，为其在抗PMO的应用提供新思路和新依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

戊酸雌二醇片(补佳乐)购于拜耳医药保健有限公司(规格：1 mg/片，生产批号：20180083)，羊抗兔Wnt、β-catenin和BMP-2多克隆抗体购于美国R&D公司，β-actin多克隆抗体及兔抗鼠二抗体购于武汉博士德生物有限公司，Prime ScriptTM反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司，PV-9000免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。DPX-L型双能X线骨密度测定仪购于美国GE公司，MTS-858型电子万能生物力学材料试验机购于美国MA公司。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组：清洁SPF级雌性SD大鼠80只，4月龄，体重(360±30)g，由中国医科大学医学实验动物中心提供，同等条件(温度：20 ℃～25 ℃，湿度：60%～70%，12 h间隔正常照明，自由饮食摄水)分笼饲养。按随机数字法分为对照组、假手术组，去势组和药物组。对照组常规饲养。

1.2.2骨质疏松大鼠造模及药物干预：参照文献[5]采用双侧卵巢切除术方法构建骨质疏松大鼠动物模型，假手术组仅切除卵巢周围等量脂肪组织，去势组和药物组均行双侧卵巢切除术。造模成功后第3天给予各组药物处理(参照大鼠体表面积比值计算)，药物组按照1 mL/100 g体质量给予0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液灌胃，对照组、假手术组和去势组给予等量0.9% 氯化钠灌胃)，1次/d，连续用药8周。

1.2.3组织取材：药物干预8周后，用2%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，采用快速心脏急性大失血法处死大鼠，逐层剥离双侧股骨，用0.9%氯化钠湿纱布和锡箔纸包裹，-20 ℃保存备用待检测。另留取部分股骨10%甲醛溶液固定，10%EDTA脱钙6周，脱水透明，制成石蜡切片，保存备用待检测。

1.2.4骨组织骨密度(BMD)测定：取出待测大鼠右股骨，室温平衡30 min，通过LUNAR双能X线吸收扫描仪扫测，采用扫描模式(扫描类型hHi-Res、扫描精度1%、扫描速度60 mm/s、扫描宽度5.0 cm、分辨率1.0 mm×1.0 mm)，用仪器选定全部股骨及股骨端上下区域，应用软件分析计算BMD值。

1.2.5骨组织生物力学测定：取出右侧股骨，室温平衡30 min，游标卡尺测量股骨长度，置于MTS-858型电子万能生物力学材料试验机进行三点弯曲力学试验，参考指标(支点跨距20 mm、最大量程1 000 N、加载速度2 mm/min)，计算机记录仪记录载荷-变形曲线，计算最大载荷、最大应力和刚度。

1.2.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的基因表达：取骨组织20 mg，液氮下充分研磨至粉末，参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，计算RNA纯度及浓度。按照反转录试剂盒说明书操作获得cDNA，加入相应PCR反应体系(20 μL)，PCR热循环仪扩增，扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火50 s，延伸30 s，40次循环扩增。实验结果以正常组为参照组，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR扩增引物序列Table 1 qRT-PCR amplification primer sequence

1.2.7HE染色观察骨组织形态学：取出石蜡切片，脱蜡水化，流水冲洗，染色(苏木精)10 min，流水冲洗，分化(盐酸酒精)10 s，流水冲洗，返蓝，蒸馏水洗涤3～5 s；染色(伊红)2～3 min，流水冲洗；再次脱水、透明，封片，光镜下观察染色并采集图片。

1.2.8免疫组织化学染色法检测股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表达：严格按照试剂盒说明书操作，PBS缓冲液作阴性对照，一抗稀释倍数(1∶200)，光学显微镜观察并采集图片，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析，结果用平均光密度值(MOD)表示。

1.3 统计学分析

2 结果

图1 各组大鼠股骨骨组织Wnt蛋白表达(×200)A：对照组；B：假手术组；C：去势组；D：药物组。Fig.1 The Wnt protein expression in femoral bone tissues of rats in each group (×200)

2.1 股骨骨组织BMD比较

对照组、假手术组股骨和上下端的BMD无显著差异(P>0.05)，去势组股骨和上下端的BMD较对照组、假手术组均显著降低(P<0.05)，药物组股骨和上下端的BMD较去势组均显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠股骨骨组织BMD比较

2.2 股骨骨组织生物力学比较

对照组和假手术组股骨最大载荷、最大应力和刚度无显著差异(P>0.05)，去势组股骨最大载荷、最大应力和刚度较对照组和假手术组均显著降低(P<0.05)，药物组股骨最大载荷、最大应力和刚度较去势组均显著升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠股骨骨组织生物力学指标比较

2.3 股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA表达比较

对照组和假手术组骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA无显著差异(P<0.05)，去势组骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA较对照组和假手术组显著降低(P<0.05)，药物组骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA较去势组显著增高(P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA相对表达量

2.4 股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表达比较

Wnt和β-catenin主要表达主要定位于成骨细胞胞膜和胞质，BMP-2主要表达定位于成骨细胞胞质，阳性反应胞质或胞膜呈黄色或棕黄色。对照组与假手术组股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)，去势组股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表达水平较对照组和假手术组显著降低(P<0.05)，药物组股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表达水平较去势组显著升高(P<0.05)。见图1～图3、表5。

图2 各组大鼠股骨骨组织β-catenin蛋白表达(×200)A：对照组；B：假手术组；C：去势组；D：药物组。Fig.2 The β-catenin protein expression of rat femoral bone tissues in each group (×200)

图3 各组大鼠股骨骨组织BMP-2蛋白表达(×200)A：对照组；B：假手术组；C：去势组；D：药物组。Fig.3 The BMP-2 protein expression of rat femoral bone tissues in each group (×200)

表5 各组大鼠股骨骨组织Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表达比较

2.5 股骨骨组织形态学比较

对照组和假手术组骨松质结构完整，骨小梁粗壮饱满、均匀致密，排列规则，连接成网状，骨髓腔较小，骨髓细胞数量丰富。去势组呈骨质疏松特征性骨松质结构改变，骨小梁明显减少，排列稀疏不规则，连接不完整，部分纤细或出现断裂现象，骨髓腔变大，有大量纤维组织。药物组骨松质骨小梁数量减少不明显，粗细均匀稍致密，排列尚规则，连续完整性较好。见图4。

图4 HE染色观察骨股骨股组织的形态结构(×200)A：对照组；B：假手术组；C：去势组；D：药物组。Fig.4 Observation of morphological structure of femoral tissue by HE staining (×200)

3 讨论

随着全球人口老龄化程度的不断加剧，PMO发病率呈逐年上升趋势，目前已成为全世界关注的健康问题之一。PMO多见于绝经后老年妇女，其并发症常见且预后不良，给家庭和社会带来了带来沉重的负担，我国已将其列为重点攻关的老年病之一[6]。对于PMO的防治研究目前已成为研究的热点问题。

雌激素水平降低是PMO的主要原因，雌激素缺乏可导致成骨细胞和破骨细胞的比例失衡，骨形成基本正常，骨吸收增强，骨转换加快，骨量丢失，引发PMO发生[7]。雌激素是目前临床应用防治PMO的首选药物，雌激素既可通过直接结合破骨细胞表面受体，抑制破骨细胞，延缓骨吸收，又可直接结合成骨细胞表面受体，调节成骨代谢等[8-9]。近年来，随着对Wnt/β-catenin信号通路研究的深入，大量研究[10]表明雌激素可通过调控经典Wnt/β-catenin信号传导通路，促进骨形成，抑制骨吸收。雌激素调控Wnt/β-catenin信号通路治疗PMO逐渐成为此领域的研究热点。

Wnt/β-catenin信号通路在骨形成和骨重建过程中起着关键性作用。细胞外Wnt因子与跨膜受体卷曲蛋白(Frz)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)相结合，通过胞质内的蓬乱蛋白(Dv)和酪蛋白激酶-1α(CK1α)传递信号，活化由轴蛋白/结肠腺瘤性蛋白/糖原合成酶激酶3β(Axin/APC/GSK-3β)复合物，使β-catenin胞质内大量聚集并进入胞核内与T细胞转录因子/淋巴增强因子(LEF/TCF)结合形成复合聚体，激活下游基因Runx2、BMP-2、c-myc等靶基因的转录[11-12]。研究[13]表明雌激素可通过激活该信号通路途径影响BMP-2活性或表达，诱导成骨细胞增殖和分化，增强成骨细胞矿化活性，抑制成骨细胞凋亡；同时调节和促进骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为成骨细胞，增加骨强度，促进新骨形成[14]。因此Wnt信号通路被认为在成骨细胞的分化、增殖、迁移等调控方面发挥了重要作用。

本研究表明，雌二醇能显著提高去势骨质疏松大鼠股骨BMD、最大载荷、最大应力和刚度，促进骨组织Wnt、β-catenin、BMP-2的表达，改善PMO骨松质结构。表明Wnt/β-catenin信号传导途径对成骨细胞增殖分化起着关键性作用，PMO大鼠骨组织Wnt/β-catenin信号通路中重要分子表达量下降，而雌二醇能通过促进Wnt/β-catenin信号通路激活下游靶基因BMP-2，上调基因表达，促进成骨细胞的增殖分化，促进骨形成，抑制骨破坏，调节骨重建系统的平衡，提高骨密度和骨生物力学性能，改善骨组织形态结构，从而起到抗PMO作用。同样黄佳等[15]通过细胞研究表明雌二醇可通过ERα/GSK-3β/β-catenin信号通路调节小鼠成骨细胞增殖。魏双双等[16]的研究表明雌激素可能通过上调Wnt16、β-catenin、OPG表达，下调RANKL表达，发挥对骨组织的保护作用，起到抗骨质疏松作用。

综上所述，雌二醇能够通过经典Wnt/β-catenin信号通路，激活BMP-2表达，促进去卵巢骨质疏松大鼠成骨细胞的增殖、分化，增加骨密度，提高骨生物力学性能，改善骨组织微观结构，具有抗PMO的作用。然而雌激素抗PMO涉及多条信号通路，各通路之间交互作用，对单一信号通路的分析是远远不够的，在后续研究中，笔者将对其他相关的信号通路进行探讨。同时，对此类药物的研究还涉及给药方式、给药剂量、药物疗程以及药物安全性等诸多问题，还需进行更加深入的研究分析与全面评估。