圈养华北豹粪便样品中雌二醇提取方法的研究

李亮亮 由玉岩 金修哲 张 卓 孙乐天卫泽珍 杨引亮 刘学锋 张成林 李晓光

(1.太原动物园，太原，030009；2.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京，100044)

华北豹(Pantherapardusfontanierii)又称金钱豹、中国豹，属于哺乳纲(Mammalia)，食肉目(Carnivora)，猫科(Felidae)，豹属，大型食肉动物，是我国特有的一个亚种，被列为国家Ⅰ级重点保护动物。

动物体内雌激素(主要是雌二醇)变化对动物发情周期有很重要的调节作用，因此测定雌二醇水平对于该物种的繁殖和保护具有重要的意义。利用血液样品来测定华北豹雌二醇的含量是一种不错的方法，但是采血时需要对动物进行麻醉保定，对动物应激很大。因此采用非损伤取样法(noninvasive sampling)，该方法具有采集样品方便，样品易于保存，同时在采样时不会对动物产生不良的应激，且粪便中雌二醇含量反映的是动物一段时间内的平均水平，能更加准确地反映动物的生理状态和繁殖性能。目前有东北虎(Pantheratigrisaltaica)[1]、狞猫(Caracalcaracal)[2]、川金丝猴(Rhinopithecusroxellanae)[3-4]、滇金丝猴(Rhinopithecusbieti)[5]、麋鹿(Elaphurusdavidianus)[6]、东北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[7]等动物粪样中激素的提取报道。但是迄今尚无关于华北豹粪样中雌激素提取方法相关的报道。为此，本文筛选了甲醇加热法、乙醇加热法和乙醇蒸馏水法3种进项实验方法，探讨适用于华北豹粪样中雌激素的理想提取方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2019年3月中旬，在太原动物园华北豹馆采集的成年雌性华北豹的粪便样品作为研究对象。选取1只健康，有繁殖史雌性华北豹作为取样对象。

1.2 粪便样品的采集与保存

前一天把兽舍打扫干净，第2天8：00—9：00采集华北豹的粪样，装入自封袋内，做好标记，存入-20 ℃冰箱，备用。

1.3 粪便样品雌二醇的提取

将粪便从-20 ℃冰箱中取出，在室温条件下进行解冻，待粪样解冻后剔除杂质，充分研磨粉碎并混合均匀，备用。

采用以下3种抽提方法进行激素的提取。

1.3.1 乙醇加热法(Ethanol-heating method)

参照Wasser等[8]的方法并进行改进优化。

(1)用电子秤称取1 g粪便于离心管中，加入80%的乙醇10 mL。

(2)然后在70 ℃振荡水浴15 min。冷却至4 ℃，离心(4 000 r/min，15 min)，取上清液至试管中。

(3)残渣加入5 mL 80%乙醇重新悬浮起，涡旋震荡1 min，离心(3 000 r/min，15 min)。

(4)合并上清液，将含有乙醇的上清液60 ℃水浴空气吹干。

(5)加1 mL，0.05 mol/L的PBS复溶，-20 ℃保存，备检。

1.3.2 甲醇加热法(Carbinol-heating method)

参照郎冬梅等[9]、李琼[10]的方法并进行改进。

(1)用电子秤称取1 g粪便于离心管中，加入90%的甲醇10 mL。

(2)在涡旋震荡仪上充分震荡1 min，置于60 ℃的恒温水浴锅中温浴20 min。

(3)之后在离心机中以4 000 r/pm离心10 min，取上清液于新的离心管中，置于-20 ℃下保存，备检。

1.3.3 乙醇蒸馏水法(Ethanol-distilled-water method)

参照高云芳等[11]方法并进行改进。

(1)用电子秤称取1 g粪便于离心管中，加入90%的甲醇10 mL。

(2)超声波振荡30 min，离心(3 000 r/min，10 min)取3 mL上清液。

(3)再加入2 mL乙醇，超声波振荡30 min，离心(3 000 r/min，10 min)。

(4)取3 mL上清液，合并两次上清液置玻璃瓶中，37 ℃水浴蒸发干燥。

(5)然后向玻璃瓶中依次缓慢加入3 mL甲醇、1 mL蒸馏水、2 mL乙醚，静置30 min，此时溶液分成上下两层。

(6)从下层中取2 mL溶液，37 ℃水浴蒸发干燥后，加入0.05 mol/L的PBS缓冲液1 mL，37 ℃水浴振荡30 min，置于-20 ℃下保存，备检。

1.4 华北豹粪样中雌二醇含量的测定

将上述3种方法抽提样品，每份各取500 μL于10 mL 离心管内，用PBS溶液进行10倍稀释确保其检测结果处于相应试剂盒的允许检测范围之内，将稀释后的样品保存于-20 ℃冰箱，备用。激素的检测工作委托北京北方生物研究所进行完成。每份样品平行测试6次。所用检测试剂盒为碘[125I]雌二醇放射免疫分析药盒试剂盒(批号：20190420)。相关试剂盒的详细参数详见说明书。

1.5 数据的分析

采用K-S检验，试验数据是否符合正态分布，然后采用单因素重复测量方差分析(one-way repeat measure ANOVA)，对具有显著差异的组合分别进行配对t-检验(paired-sampletttest)方法，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

变异系数是衡量各组(项)观测值变异程度的统计量，标准差与平均数的比值为变异系数，用C-V来表示，变异系数小则方法组合的稳定性高。公式为：C-V=SD/Mean×100%。

所有统计检验通过SPSS 20完成，所有数据的特征用平均数±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对圈养华北豹粪便样品中雌二醇提取含量的对比

甲醇加热法测得的含量为(2 815.47±297.47)pg/mL，乙醇加热法测得的含量为(7 660.25±1 546.11)pg/mL，乙醇蒸馏水法测得的含量为(1 937.83±231.71)pg/mL。其中利用乙醇加热法提取的雌二醇含量为高。以抽提方法为组内因子，对粪便中雌二醇含量检测结果进行单因素重复测量方差分析，结果表明，甲醇加热法与乙醇蒸馏水法2种提取方法的测定结果间无明显差异，甲醇加热法和乙醇蒸馏水法与乙醇加热法测定结果间差异显著。实验结果见表1。

2.2 不同提取方法对圈养华北豹粪便样品中雌二醇提取含量的对比

变异系数的大小能够表征检测的稳定性，变异系数大则方法组合的稳定性差，变异系数小则方法组合的稳定性高。对于本研究而言，甲醇加热法(21.02%)和乙醇加热法(20.18%)的变异系数接近，说明这两2方法提取的雌二醇稳定性接近，甲醇加热法(21.02%)和乙醇加热法(20.18%)的变异系数小于乙醇蒸馏水法(27.03%)，说明乙醇蒸馏水法提取雌二醇稳定性不如另外2种方法。实验结果见表2。

表1 不同方法提取粪样中雌二醇含量测定结果(Mean±SD)

表2 不同抽提方法的变异系数

3 讨论

本研究结果表明，不同的提取对华北豹粪便中雌二醇的提取效率有显著差异。甲醇加热法提取效率低；乙醇蒸馏法稳定性明显偏低且步骤烦琐，不利于处理大批量的粪样样品。乙醇加热法是经典、高效率的雌二醇抽提方法，该方法已经在多个动物的粪样雌二醇的提取中，有理想的应用效果[8，12-13]。

化学免疫分析法是最早用于激素检测的免疫检测法，20世纪50年代，就通过放射免疫技术在人的粪便中检测到了雌二醇[14]。随后，此项技术应用于家畜牛中，该方法的灵敏度高，结果稳定，若条件允许，可以选用化学免疫分析法进行雌二醇水平检测。

在本次实验中，所采集的华北豹的粪便样品均来自同一只动物，采集的动物样本数量相对较少。为了保证实验数据的准确可靠，在实验中增加了样本的重复数(6次)，以此减少误差，达到确保数据的准确可靠目的。

综上所述，建议在提取华北豹粪便中雌二醇时，以乙醇加热法提取粪便中雌二醇为较理想的一种提取方法。