秦岭大熊猫繁殖期尿液中生殖激素变化规律的研究

沈洁娜 李根新 张 强 张丹辉 王 宾杨创学 高更更 雷颖虎* 赵鹏鹏*

(1.陕西省林业科学院秦岭大熊猫繁育研究中心，周至，710402；2.陕西省西安市鄠邑区祖庵镇人民政府，西安，710308)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)属于季节性单次发情动物，每年春季发情1次，发情期约1—2周。一般每次发情排卵期仅为l—2 d，排卵数1—2枚，偶有3枚[1]，大熊猫的妊娠期差异很大，最短89 d，最长186 d[2]，张志和等[3]曾对51次圈养大熊猫妊娠期进行统计，平均妊娠期为(144±20)d。大熊猫在繁殖期易受外界环境如地理位置、气候状况、生存环境的影响而发生变化，目前国内外对于大熊猫生殖内分泌的研究较多，但对于秦岭大熊猫的报道鲜有，该研究采用ELISA检测方法探索秦岭大熊猫繁殖期尿液中生殖激素变化规律，旨在确定最佳人工授精时间及成功受孕的大熊猫产仔时间，为提高秦岭大熊猫人工种群数量提供参考价值。

1 材料和方法

1.1 实验对象

陕西省林业科学院秦岭大熊猫繁育研究中心成年雌性大熊猫，年龄6—19岁不等。

1.2 样品收集

大熊猫发情前期每周采集2次新鲜尿样，以确定激素基础值，发情初期每天采集尿样1次，中期每天采集2次，高峰期每间隔3—4 h采集1次，配种后每天采集尿样1次，直至产后1周或假孕结束。每次采集尿样约3 mL，样品-20 ℃保存，发情高峰期采样后直接检测。

1.3 实验仪器及试剂

抗体(E1G-Ab、P4-Ab)、酶标抗原(E1G-HRP、P4-HRP)、标准品(E1G-st、P4-st)来自Smithsonian Institution；羊抗兔、羊抗鼠、肌苷酸标准品、TMB、NaOH等常规试剂均来自Sigma-Aldrich；酶标板来自Thermo Fisher Scientific；酶标仪型号DNM-9602系列酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司，中国。

表1 大熊猫基本信息

1.4 数据统计分析

使用酶标仪自带软件读板，用Microsoft Excel 97-2003对数据进行统计分析。

2 结果

统计2017—2019年参与繁殖的雌性大熊猫配种时间及产仔情况(表2)。

表2 2017—2019大熊猫配种及产仔情况

该16例雌性大熊猫繁殖期虽然E1G/Cr与P4/Cr变化时间与峰值数值不同，但是E1G/Cr与P4/Cr的变化趋势是类似的，因此该文中没有逐一列出每一例大熊猫激素变化图，而是利用 Microsoft PowerPoint 画出了一个简化模式图(图1)，仅代表2种激素变化趋势，以直观显示各阶段变化规律。

2.1 发情期雌性大熊猫生殖激素变化

上述15例(不包含2017年4#)大熊猫发情持续天数6—15 d不等，最短6 d(7#2019)，最长15 d(4#2019)，平均10.8 d；其中1—5月发情11例，占73.3%，6—7月发情4例，占26.7%。对比6、7月和1—5月发情大熊猫的激素变化水平和发情持续天数，没有明显差异。大熊猫发情前期雌激素和孕激素均处于较低水平，进入发情期后，雌激素逐渐上升，孕激素开始下降，当雌激素到达峰值后会快速下降，孕酮则逐渐上升，E1G峰值58—240 ng/mgCr，平均147.7 ng/mgCr。

该15例均为人工授精，平均首次人工授精时间在E1G/Cr峰值后29.8 h，即在当雌激素从峰值开始下降，孕酮持续上升时为最佳人工授精时间。结果显示有7例大熊猫受孕(1#2017，1#2019，2#2017，2#2019，以及3例流产，4#2017年虽然成功产仔，但配种未在我中心完成，故未计算在内)，成功率为46.7%，冯文和[4]等对1980—1993年圈养条件下的大熊猫155次不同配种方式的繁殖结果进行统计，全人工授精的产仔率为20.4%，说明本研究最佳人工授精时间的判断是合适的。

对比发现，P4/Cr在E1G/Cr峰值前开始上升，平均首次人工授精时间在E1G/Cr峰值后24.2 h，低于平均时间；P4/Cr在E1G/Cr峰值后开始上升，平均首次人工授精时间在E1G/Cr峰值后32.6 h，高于平均时间。P4/Cr在E1G/Cr峰值前开始上升E1G/Cr下降的速度更快，P4/Cr的持续上升意味着已经排卵，因此人工授精时间提前。不同大熊猫P4/Cr有可能在E1G/Cr峰值前上升，也有可能在E1G/Cr峰值后上升，且同一只大熊猫在不同年份的发情，P4/Cr上升有可能在E1G/Cr峰值前，也可能在峰值后(3#2017年与2018年、5#2018年与2017、2019年)。

在不同年龄的雌性大熊猫中，初情大熊猫平均人工授精时间距离EC/CR峰值较经产大熊猫早约5.1 h。

2.2 配种后雌性大熊猫生殖激素变化

雌性大熊猫配种后雌激素一直处于较低水平，孕激素在配种后有小幅度升高，在小范围内波动并处于较为稳定状态，此阶段(T2)大熊猫普遍食欲旺盛，正常活动(表4)。

图1 雌性大熊猫繁殖期雌激素(E1G/Cr)与孕酮(P4/Cr)变化规律示意图Fig.2 Schema of changes in estrogen(E1G)and progesterone(P4)of female giant pandas during reproduction

表3 发情期生殖激素不同表现类型与平均首次人工授精时间(T1)对比

表4 产仔与未产仔大熊猫P4不同阶段平均时间对比

5例产仔大熊猫T2平均为94 d，3例流产大熊猫T2平均为92 d，假孕大熊猫为91 d，未见明显差异。T3为P4快速上升阶段，产仔与流产、假孕大熊猫均在2周左右时间达到孕激素峰值，该阶段大熊猫未表现出明显差异，并均出现减食现象。对比孕激素峰值，产仔大熊猫平均孕激素峰值为1 229 ng/mgCr，高于假孕大熊猫。T4阶段为P4峰值到大熊猫产仔时间，产仔大熊猫在P4峰值后平均23 d后产仔，流产大熊猫平均31 d后流产。该研究中有3例流产案例，2018年3#与5#流产表现极其类似，均在P4峰值后36 d和38 d出现流产现象，不同的是5#2019年又发生流产，但在P4峰值后18 d出现流产现象，2019年5#因有羊水流出及不明红色团块样组织流出，以及产后恶露陆续排出，故推测其成功受孕，但胎儿未能成活，其流产原因还有待进一步检查分析。

产仔大熊猫妊娠期平均为132 d，产后或假孕结束孕激素会逐渐下降至休情期水平并维持在低水平上，直至下次大熊猫发情出现新一轮的周期性变化。

3 讨论

冯文和等[4]认为雌性大熊猫配种或输精较适时间在发情高峰期与发情后期之间，其次为发情高峰期。在大熊猫发情高峰前进行人工授精是不适当的，发情前期大熊猫卵巢尚处于卵泡发育阶段，尚未排卵，若此时进行麻醉人工授精可能抑制大熊猫排卵。但过晚的人工授精由于卵子受时间限制活力减弱，配种将导致其受孕率降低[5]。本研究成功产仔大熊猫的首次配种时间均在峰值后，与冯文和等结论一致。

大熊猫配种后孕激素P4的变化可分为3个时期(T2、T3、T4)，T2阶段孕激素维持在一定水平，未表现出明显上升，若大熊猫成功受孕，此时受精卵可能表现出延迟着床现象，延迟着床被认为是由黄体不足引起的[6-7]。T3阶段孕激素快速上升，受精卵有可能在该阶段着床，一般哺乳动物的孕酮在妊娠期间主要由胎盘分泌，随着妊娠期胚胎的发育，胎盘的体积也逐渐增大，也会分泌更多的孕酮[8]，以促进胎儿更好地发育。配种后假孕大熊猫与成功受孕大熊猫孕激素有相似的变化规律，甚至未配种的雌性亚成体大熊猫也有假孕现象，并同样有相似的变化规律，其原因还有待进一步探索。