骨髓间充质干细胞来源外泌体对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用研究

田珂

（南方医科大学南方医院麻醉科 广东 广州 510515）

缺血性再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是引发急性肾损伤的主要原因，尤其是在肾脏移植的过程中，IRI情况无法避免，继而当此情况发生时，不仅会对术后肾功能恢复造成影响，还会影响移植肾的长期存活[1-2]。因此，如何对IRI的生物学机制寻找有效保护与干预措施，在临床一直当做重要问题进行探究。在临床探究的结果中发现，充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）有修复与再生以及免疫调节功能，并且外源性MSC 可对急性肾损伤进行减轻[3-4]。但临床研究资料较少，存在争议性，加之，近几年的临床中发现，外泌体（exosme）可作为细胞间相互作用的重要手段，exosme 会通过膜受体或是内吞的方式进入靶细胞，并向其传递exosme 中所携带的蛋白质等细胞，产生信号复合体，激活相关分子信号通路[5-6]。因在MSC 所分泌的exosme 体积比较小，肉眼不能见到，不明确若大量提取MSC 所分泌的exosme 对IRI 所引起的急性肾损伤是否存在保护作用[7]，因而为证实这一依据，本次探究选取在我院实验室中的SPF 级雄性SD 大鼠21 只，探究骨髓间充质干细胞来源外泌体对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用，现将结果报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取SPF 级雄性SD 大鼠21 只，均饲养于我院实验室中，时间2015 年4 月—2017 年7 月，大鼠重量范围在200g ～250g，平均重量在（224.1±14.5）g，将实验室大鼠进行分组、肾脏IRI 模型的建立：首先将21 只SD 雄性大鼠随机数字分为3组，假手术组（Sham 组），缺血再灌注组（IR 组），MSC 来源exosme 处理组（IR+MSC-ex,100μgexosme/1mlPBS），每组7 只。

1.2 方法

首先建立大鼠肾脏IRI 模型：右侧的输尿管先进行结扎，在将右肾与肾蒂进行切除，继而暴露左侧肾脏，以无创血管夹夹闭左肾蒂45min，取气管从旁侧行纵行切口对皮肤、肌肉进行切开，将左侧颈动脉进行游离，以24G 静脉穿刺针行颈动脉穿刺，完成后使用套线对其固定，给予各组相应注射治疗，结扎颈动脉。术后将每组大鼠分开饲养，自由饮食。

其次进行标本收集与病理学检测：48h 各组大鼠会因颈椎脱臼而被处死，使用相关仪器对血清肌酐尿素进行查验与检测，并将血清与大鼠中的肾组织当作标本。用4%甲醛对各组大鼠肾脏组织进行固定，后使用石蜡包埋，常规HE 染色，在200 倍光镜下，选取10 个肾小管在10 个视野中进行评测，观测过程中视野要在400 倍，数量选取20 个。然后对20 个视野下的肾小管细胞凋亡数量进行记录，并将其组织平均数进行切片评分。

最后为组织蛋白提取：肾脏组织匀浆裂解后提取蛋白，用β 肌动蛋白为内参照，每组实验分别重复3 遍。

1.3 观察指标

血肌酐、尿素氮：观察记录三组实验白鼠术后48h 肾脏血肌酐、尿素氮水平并进行对比。

肾组织病理改变：观察记录三组实验白鼠术后肾组织病理变化并进行对比。

TUNEL 凋亡检测：观察记录三组实验白鼠TUNEL 凋亡检测结果并进行对比。

肾组织蛋白水平：观察记录三组实验白鼠肾组织蛋白水平并进行对比。

1.4 统计学分析

运用PSS23.0 统计学软件处理数据。数值变量数据采用（）表示，采取t 检验或F 检验；无序分类数据以百分比率（%）表示，采取χ2检验；P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 Sham 组、IR+MSC-ex 术后48h 肾脏血肌酐、尿素氮水平与IR 组相比，均有明显下降，且有明显差异，有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 观察记录三组实验白鼠术后48h 肾脏血肌酐、尿素氮水平并进行对比（，μmol/L）

表1 观察记录三组实验白鼠术后48h 肾脏血肌酐、尿素氮水平并进行对比（，μmol/L）

注：假手术组（Sham 组），缺血再灌注组（IR 组），MSC 来源exosme 处理组（IR+MSC-ex,100μgexosme/1mlPBS）。

组别 n 血肌酐 尿素氮Sham 组 7 88±25 7.38±0.91 IR 组 7 456±34 47.52±2.91 IR+MSC-ex 7 242±32 32.98±5.61 F-255.713 212.738 P-0.000 0.000

2.2 肾组织病理改变结果：Sham 组未见组织病理损害，IR组有明显病理损害，即表现为肾小管结构被破坏且细胞肿胀变性，肾小管管腔扩张，可见管型，且伴有肾见出血、水肿现象，炎细胞被浸润。IR+MSC-ex 比IR 组损害较轻。

2.3 TUNEL 凋亡检测结果：Sham 组未见明显凋零亡细胞，IR 组凋亡肾小管上皮细胞明显增多，管腔内存在凋亡细胞。IR+MSC-ex 与IR 组比较，凋亡细胞明显减少。

2.4 肾组织蛋白水平结果：IR组肾组织蛋白水平明显增高，IR+MSC-ex 相较IR 组蛋白水平有明显降低，Sham 组无变化。

3.讨论

MSC 可分化为多种细胞，且所被分化的多种细胞中都存在潜在的多能干细胞，此外MSC 具有归巢能力。Exosme 会存在与晚期MSC 细胞的多泡体中，呈现形式是以腔内囊泡存在，在MSC 中可承担旁分泌作用，即可在多泡体中与细胞壁融合释放。Exosme 肉眼是无法看到的，较为规范的定义是为，直径约在30～130mm，密度在1.13 ～1.21g/dl 之间，例如CD63/MHC 类分子。在本实验中，是通过透射电镜对exosme 进行观察，并提取exosme 中结构，名为微囊小体结构，即直径在30 ～60mm 圆形或是椭圆形，大小基本一致，通过透射镜观察可判断出exosme是MSC 所分泌的来源外泌体。

在本次实验中，正式MSC 所分泌的exosme 可对肾脏的TRI 形成保护作用，即在IRI 中，组织损伤的表现形式为细胞凋亡，继而导致DNA 断裂。在本次的实验中，在出现IRI 后，TUNEL 染色阳性细胞就停留在肾小管上皮，由此可知，缺血再灌注会直接引起肾小管上皮细胞的凋亡，而IR+MSC-ex 与IR组相比凋亡细胞有明显的较少，由此可证明，MSC 所分泌的exosme 可对肾脏IRI 后肾小管上皮细胞形成保护作用。最后在本次实验结果中，MSC 来源exosme 可有效抑制并减轻肾损伤，而IR+MSC-ex 对肾脏无明显保护作用，由此可知exosme作用与来源有紧密联系，并且MSC 还可通过旁分泌细胞因子等发挥其保护作用。

综上，大鼠中的充质干细胞（MSC）来源外泌体（exosme）可对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有保护作用，可降低凋亡水平，改善蛋白质水平，改善肾脏水平。