p16ink4 及ki67 在宫颈脱落细胞中的表达水平与HPV16/18 感染的相关性分析

徐秀梅 米贤军 钟守军 黄永霞 黄兆

( 中山市博爱医院病理科 广东 中山 528400)

从病毒学上来看，HPV 为人乳头瘤病毒，是一种通过感染人的皮肤及粘膜环状DNA 分子病毒[1]，而不同类别基因型的HPV病毒感染人体的不同部位后也会出现不同的反应与结果，目前研究确定的HPV 基因中有42 型可以感染人体并引发相关疾病，其中高危型的如16、18 型可以导致人体宫颈内上皮内瘤变甚至宫颈癌的发生[2]，较为低危的HPV 病毒则会导致人体尖锐湿疣的发生等，HPV 病毒主要是通过侵入人体细胞，使正常的基因功能失控，高危型的HPV 病毒会导致宫颈细胞的恶性增值而最终引起宫颈癌前病变，并有进一步发展为宫颈癌的可能。宫颈癌虽然作为一种恶性肿瘤，但其特点在于存在较长的从癌前病变发展为宫颈癌的过程，且针对癌前病变的早期治疗可以显著提高患者的5 年生存率，因而早期识别并检出宫颈癌前病变就变得十分重要[3-5]。

宫颈癌是目前女性恶性肿瘤发病率第二的最常见肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，且还有上升趋势，因而宫颈癌越来越受到世界的关注，如何早期识别诊断出乳腺癌，早期采取措施早期治疗，也是人们普遍关注的问题，我国宫颈癌的发病率就已经占到了世界的1/3，实在可以称得上是宫颈癌大国[6]。根据现有的流行病学数据来看，超过90%的宫颈癌与人乳头瘤病毒HPV 感染相关，因其E6、E7蛋白可以与抑癌基因P53的产物蛋白相结合，从而引起p53 基因的失控性表达，进一步促进细胞周期相关蛋白质p16ink4、ki67 的表达。现有研究表示p16ink4、ki67 的表达可能先于宫颈非良性病变出现，更有一部分研究显示p16ink4在宫颈脱落细胞中的阳性表达与HPV 具有很强的相关性，这就为p16ink4、ki67 在宫颈脱落细胞中的表达与HPV16/18 的感染相关性提供了一定的理论基础[7-9]。

p16ink4 作为一种肿瘤抑制因子，被证实参与了多种肿瘤的发生，其可以防止细胞正常周期的失调控、无限制增殖、进一步向肿瘤转化。而ki67 作为一种DNA 结合蛋白，表达与细胞周期中的多个阶段，表达程度反映了细胞的增生状态，因而其异常表达时可以反映肿瘤细胞的异常增殖潜能，被广泛用于评估肿瘤细胞的增值[10]。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选2018—2019 年在我院进行宫颈脱落细胞学检查的200 例患者标本，经10%福尔马林固定，石蜡包埋后采用免疫组织化学的方法对其标本的鳞状上皮、宫颈上皮内瘤变、浸润癌等进行p16ink4、ki67 检测，同时对标本应用多重引物的PCR 技术进行HPV16/18 表达的检测，对两组相关性进行探讨分析，结果采用统计学方法进行处理。

1.2 方法

1.2.1 实验前准备 进行免疫细胞化学和免疫组织化学玻璃仪器的处理，包括肥皂水煮沸、浓酸浸泡48 小时、载玻片备用等，同时准备好相应试剂。

1.2.2 免疫组织化学方法 对所有标本进行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，经PBS 浸泡5min，3%的过氧化氢溶液室温保存10min，再次进行微波修复，后各自滴加p16ink4（1:100）、ki67（1:50），放入4℃环境中冷藏一夜，然后经显色、复染、酒精化、脱水、封片等步骤，等待结果。

全部患者均接受Cervista 高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）检测、阴道镜活检，利用免疫荧光双标检测蛋白表达。免疫荧光双标检测经Thin－Prep2000 对剩余液基细胞保存液重新制片，检测加入鼠抗人P16 和兔抗人Ki67，一抗选择磷酸盐缓冲液代替当成阴性对照，Cy3（红色荧光）、FITC（黄绿色荧光）标记的抗鼠、抗兔为二抗，利用荧光显微镜观察结果。

应用全自动免疫组化染色仪（深圳市森盈公司的全自动免疫组化染色系统SY7300）进行免疫组化染色，每批染色设置均设已知阳性及阴性对照。

1.3 结果判定

1.3.1 ki67 结果判定 ki67 主要在细胞核中表达，当细胞被染成棕黄色则视为阳性结果，选取高倍镜视野下的一千个细胞计算相应着色鳞状上皮细胞的比例，记为ki67 阳性指数。

1.3.2 p16ink4 结果判定 p16ink4 着色部位为细胞核和细胞浆，同ki67，当细胞核或者细胞浆出现着色时即视为结果阳性，再根据着色部位进行分类与评价，包括细胞核着色、细胞浆着色、细胞核和细胞浆着色。

1.4 统计学方法

使用SPSS18.0 统计学软件对实验结果进行统计学处理，不同病变级别的HPV 感染率用χ2检验进行分析，P ＜0.05 时视为差异没有统计学意义。

2.结果

在宫颈脱落细胞中，p16ink4、ki67 在宫颈脱落细胞中的表达水平具有可以参考的临床意义，因其表达水平的规律性表现为ki67 与p16ink4 的表达水平随着宫颈上皮细胞损伤程度加重而表达上升，且在浸润性癌中的阳性结果最高，超过了90%，而HPV16/18 的阳性率也随着宫颈脱落细胞的损伤程度的加重而上升，见表1、表2。

表1 活检组织中KI67 标记指数和p16ink4 阳性率的表达

表2 细胞学、HR-HPV 检测用于评价宫颈高级别病变的价值（%）

3.讨论

宫颈癌作为世界上女性最易发病的恶性肿瘤之一，越来越受到了世界的关注，如何早期识别及诊断出乳腺癌，早期采取措施早期治疗，也是人们普遍关注的问题。我国宫颈癌的发病率就已经占到了世界的1/3，实在可以称得上是宫颈癌大国。液基薄层细胞学检查（TCT）和人乳头状瘤病毒（HPV）检测是目前筛选宫颈癌较为常用的手段，但目前的水平仍存在一定的假阳性和假阴性的情况，需要寻找一种早期，高敏、高度特异性的方法来早期诊断出宫颈癌的发生，从而预防宫颈癌。

根据现有的流行病学数据来看，超过90%的宫颈癌与人乳头瘤病毒HPV 感染相关，有研究证实，高危型的HPV 感染可以导致宫颈发生上皮内瘤变，并有极大的风险进一步发展成宫颈癌，其机制是原癌基因编发的蛋白可以通过一系列机制使得高危型的HPV-E7 基因编码的癌基因蛋白整合到宿主细胞中去后，与Rb蛋白结合，使得pRb 失活，从而失去了对p16ink4 基因表达的抑制作用，p16ink4 的过度表达会进一步造成肿瘤细胞内的E2F 游离型增多，使得cycinD/CDK4 蛋白复合物过度表达，而cycinD/CDK4 蛋白复合物又可正反馈刺激p16ink4。

p16ink4、ki67 的表达可能先于宫颈非良性病变出现，更有一部分研究显示p16ink4 在宫颈脱落细胞中的阳性表达与HPV 具有很强的相关性，这就为p16ink4、ki67 在宫颈脱落细胞中的表达与HPV16/18 的感染相关性提供了一定的理论基础[11-12]。

针对2018-2019 在我院进行宫颈脱落细胞学检查的200 例患者标本，经10%福尔马林固定，石蜡包埋后采用免疫组织化学的方法对其标本的鳞状上皮、宫颈上皮内瘤变、浸润癌等进行p16ink4、ki67 检测，同时对标本应用多重引物的PCR 技术进行HPV16/18 表达的检测，对两组结果相关性进行探讨分析。

综上，针对宫颈脱落细胞中ki67 及p16ink4 基因进行检测，发现若其表达上调，则与高危型宫颈上皮内癌变具有很大的相关性，与传统的液基薄层细胞学检查（TCT）和人乳头状瘤病毒（HPV）检测方法相比，可以早期怀疑宫颈癌的发生，用于临床上早期宫颈病变的筛查[13-14]，且其假阳性率和假阴性率较之液基薄层细胞学检查（TCT）和人乳头状瘤病毒（HPV）检测技术均有明显降低，具有更高的准确度，更早期的表达，取材方便患者痛苦小等优势[15]，均可以作为临床早期筛查宫颈癌及其癌前病变可以考虑的一项辅助检查手段，而其标准值的确认等，尚需更严谨的进一步实验探究证实。