线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂对冠心病大鼠心肌细胞影响及机制研究

谢玉霞 姜海兵 杨 洁 张 静 梁 铖 刘文宁

冠心病作为严重危害人类健康的疾病之一，近年来的发病逐渐趋于年轻化，且病死率一直居高不下[1，2]。冠心病的发病以动脉粥样硬化为基础，动脉粥样硬化引发心肌细胞的损伤，推进冠心病的病理进程，缓解心肌细胞的损伤亦是临床上控制冠心病的重要环节之一[3,4]。因此，发现更多能够有效控制心肌细胞损伤的药物至关重要。ATP敏感性钾离子通道是位于心脏和血管平滑肌上且能够被细胞内ATP和其他腺嘌呤核苷酸抑制的内向整流 K+通道，其中线粒体 ATP 敏感性钾离子通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP)广泛的存在于线粒体内膜上，当细胞内 ATP 消耗降低时，该通道开放，促进线粒体氧化磷酸化产生ATP[5,6]。二氮嗪作为mitoK-ATP开放剂已经被证明具有对抗心肌损伤的作用，但其对心肌细胞的作用机制研究尚不完善。本研究旨在探讨二氮嗪对冠心病大鼠心肌细胞影响及机制，为临床研究提供帮助[7,8]。

材料与方法

1.材料: 健康清洁级SD大鼠，50只，体质量150±20g[新疆医科大学动物实验中心,实验动物许可证号：SCXK(新)2018-0011]；高脂饲料(南京卡文斯生物技术有限公司)；垂体后叶素(安徽宏业药业有限公司)；苯妥英钠(南京谷歌生物技术有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6检测试剂盒(福麦斯生物技术有限公司)； 原位缺口末端转移酶标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)凋亡检测试剂盒(北京素莱宝科技有限公司)；Kir6.2、ERK1/2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体，山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；电泳仪(南京大学仪器厂)；微型垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

2.冠心病大鼠造模: 50只大鼠随机分为5组，分别为对照组、模型组、二氮嗪低、中、高剂量组；除对照组外，其余各组大鼠高脂饮食6周后腹腔注射垂体后叶素(30μg/kg)，1次/24h，共3次，构建冠心病大鼠模型；造模后给药治疗14天，二氮嗪低、中、高剂量组给药剂量分别为3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg，每天灌胃给药1次，对照组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液。

3.Elisa检测血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平: 实验结束后，腹腔注射 50mg/kg 苯妥英钠麻醉大鼠，腹主动脉取5ml全血，室温静置4h后，3500r/min，4℃离心15min，分离上层血清，按照Elisa试剂盒检测方法，主要步骤为铺好一抗的96孔板内加入40μl待测样品和10μl生物素标记抗体后，加入100μl辣根过氧化物酶标记抗体，37℃孵育75min，清洗96孔板后加入显色剂显色，终止后于酶标仪450nm处测吸光度，根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

4.HE染色检测心肌组织病理变化: 给药结束后，腹腔注射50mg/kg苯妥英钠麻醉大鼠，摘除大鼠心脏并将其置于冰上，用医用纱布包裹轻轻按压排净心脏内血液，并在距心尖2mm 处沿横向将其切开，取宽约 2mm 的心脏组织放于组织固定液中固定72h，其余部分于-80℃保存。固定后将组织用梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋后制成组织切片，然后将石蜡切片进行透明水化，HE染色、封片后于显微镜下拍照，观察组织病理变化。

5.TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡: 将制备好的石蜡切片经常规二甲苯及各梯度乙醇脱蜡至水，蒸馏水水化5min，用0.1mol/L枸橼酸缓冲液(pH=6.0)中进行热修复，分别经过3%H2O2甲醇液、0.1%TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反应混合液、过氧化物酶(peroxidase, POD) 转化剂孵育及磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)冲洗后，二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB) 溶液显色，并在显微镜下观察，终止后用迈耶苏木精染核，PBS 冲洗后，甘油封片剂封片，显微镜下观察并采集图像。

6.Western blot法检测心肌组织Kir6.2和caspase-3的表达水平: 取各组大鼠心脏组织约 60mg于10ml EP管中，加入500μl RIPA 蛋白裂解液及5μl的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，于组织匀浆机中匀浆均匀，然后将各组样品 4℃低温下裂解 30min后置于 4℃离心机中12000r/min离心10min并取上清液，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量法检测总蛋白的含量。进行十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate, SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)对PVDF膜封闭2h，然后以稀释后的GAPDH、 Kir6.2和ERK1/2一抗4℃孵育过夜，洗膜后室温孵育二抗1.5h，洗膜后将聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜浸入发光液，曝光并拍照，用Image J软件曝光结果进行定量分析。

结 果

1. 血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6检测结果: 与对照组比较，模型组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，二氮嗪低、中、高给药组其血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6显著降低(P<0.05)，呈剂量依赖性(表1)。

2.HE染色结果: 对照组大鼠心肌组织结构完整，心肌细胞排列整齐，细胞形态正常，未表现出明显的病理损伤；模型组大鼠心肌结构损伤严重，心肌细胞大面积坏死，心肌细胞水肿严重，有大量炎性细胞浸润，表明造模成功；二氮嗪低剂量组，心肌细胞损伤较模型组有所缓解，炎性细胞浸润有所减少，但仍存在显著的病理损伤；二氮嗪中、高剂量组心肌组织损伤显著缓解，病变部位局限，心肌细胞排列整齐，心肌水肿减弱，且呈剂量依赖性(图1)。

表1 各组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6检测结果比较

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果(×20)A.对照组；B.模型组；C.二氮嗪低剂量组；D.二氮嗪中剂量组；E.二氮嗪高剂量组

3.原位缺口末端转移酶标记法(TUNEL)检测大鼠心肌细胞凋亡结果: 与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡数目显著增多(P<0.05)，提示冠心病大鼠心肌细胞凋亡严重，从而造成心肌组织损伤；与模型组比较，二氮嗪低、中、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡数目显著减少(P<0.05)，且呈现剂量依赖性(图2)。

4.Western blot法检测Kir6.2和ERK1/2的表达：与对照组比较，模型组大鼠心肌组织Kir6.2表达量增加(P<0.05)，提示可能是由于冠心病心肌细胞损伤引起Kir6.2表达代偿性增高，其余各组Kir6.2表达量均显著升高(P<0.05)，提示线粒体ATP敏感性钾离子通道处于大量开放状态；与模型组比较，二氮嗪低、中、高剂量组大鼠心肌组织Kir6.2表达量均显著提高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。与对照组比较，模型组大鼠心肌组织ERK1/2表达量显著增高(P<0.05)，与模型组比较，二氮嗪低、中、高剂量组ERK1/2表达量显著减少(P<0.05)，且呈剂量依赖性(图3)。

图3 各组大鼠心肌组织Kir6.2和ERK1/2表达水平A.Western blot法检测结果；1.对照组；2.模型组；3.二氮嗪低剂量组；4.二氮嗪中剂量组；5.二氮嗪高剂量组;B.各组大鼠心肌组织蛋白相对表达量；与对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05

讨 论

冠心病作为心血管疾病之一，一直是国内外心血管方向研究的重点，心血管疾病大多发病机制复杂，治疗困难，且患者预后较差。目前临床治疗冠心病的主要是通过手术和药物治疗，在药物治疗中，保护心肌细胞，阻止其进一步损伤是重要的环节[9]。有研究表明，心肌细胞特有的ATP敏感性钾离子通道的开放对心肌细胞有显著的保护作用，主要表现在线粒体内膜上的ATP敏感性钾离子通道开放可以促进线粒体氧化磷酸化产能，二氮嗪作为高选择性线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂，低剂量即可有效诱导其开放[10～12]。本研究通过构建冠心病大鼠模型，探究了二氮嗪对冠心病大鼠心肌组织细胞的影响及机制。

炎性反应贯穿冠心病发生发展的全过程，已有研究表明，冠心病患者血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的升高导致动脉斑形成加速、血栓形成加速、血管通透性增加等病理现象，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子亦可作为动脉粥样硬化的治疗靶点[13]。本研究结果显示，二氮嗪能够显著降低冠心病大鼠血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，提示二氮嗪具有能够显著抑制炎性反应的作用。

细胞凋亡是指细胞内部一系列基因调控的改变而引起的细胞程序性死亡，已有研究表明，动脉粥样硬化、冠心病、心律失常等心血管疾病均与心肌细胞的凋亡有关[14～16]；在细胞早期凋亡的过程中会消耗大量的ATP，引起细胞能量代谢不足而大面积凋亡，二氮嗪作为线粒体ATP依赖性钾离子通道开放剂能够增加线粒体产能为细胞提供能量，缓解细胞的凋亡[17]。本研究结果显示，二氮嗪能够显著抑制冠心病大鼠心肌细胞的凋亡，且呈剂量依赖性，提示二氮嗪或可通过抑制细胞凋亡而缓解冠心病的进程。

Kir6.2是线粒体ATP敏感性钾离子通道之一，本研究发现，二氮嗪能够显著促进Kir6.2的表达，且呈剂量依赖性，说明二氮嗪在体内有效促进线粒体ATP敏感性钾离子通道的开放。在炎性反应中，ERK1/2信号通路的激活始于转运和活化Raft，后者磷酸化激活 ERK1/2[18]。ERK 是一种丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，可将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，介导细胞生物化学反应，如凋亡、增殖、转化等[19，20]。本研究发现，二氮嗪能够显著抑制冠心病大鼠心肌细胞ERK1/2的表达。

综上所述，线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂二氮嗪能够对心肌组织结构有显著的保护作用，并且能够缓解冠心病大鼠心肌细胞的凋亡，其作用机制可能为抑制体内炎性反应，以及降低冠心病大鼠心肌组织中ERK1/2的表达，从而抑制心肌细胞的凋亡，但具体的治疗机制还需要进一步探讨。