CNP对急性心肌缺血大鼠室性心律失常的影响

何 燕 刘 育 周明敏 谢 轲

致死性室性心律失常诱发的心源性猝死是缺血性心脏疾病的主要死因[1]。研究表明，急性心肌缺血后交感神经系统过度激活，释放去甲肾上腺素等神经递质，导致心电活动不稳定，是引发室性心律失常的重要机制[2]。许多抑制交感神经活性的方法已被证明可以减少室性心律失常和心源性猝死，但仍存在一些不可避免的不良反应[3,4]。C型利钠肽(C-type natriuretic peptide，CNP)主要与利钠肽B型受体(natriuretic peptide receptor B，NPR-B)和利钠肽C型受体(natriuretic peptide receptor C，NPR-C)结合，通过抗纤维化、抗过度肥大和抗炎症等生物学效应在心血管疾病中发挥作用[5,6]。近期研究表明，CNP可通过抑制交感神经末梢递质的释放，降低交感神经活性[7]。为探究CNP能否通过抑制交感神经激活发挥对急性心肌缺血的保护作用，本实验通过建立大鼠急性心肌缺血模型，观察CNP对急性心肌缺血后室性心律失常的影响。

材料与方法

1.实验动物及分组：雄性SD大鼠40只，体质量220～280g，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK(湘)2016-0002，于武汉大学动物实验中心适应性喂养1周。大鼠随机分为假手术组(n=10)、急性心肌缺血组(模型组，n=15)和CNP干预组(CNP组，n=15)。CNP(500微克/支，美国R&D Systems公司)溶于生理盐水，于造模前30min由股静脉泵入[初始剂量20μg/kg；维持剂量2μg/(kg·min)，容量为10ml/kg]，持续1.5h，模型组和假手术组给予等量0.9%氯化钠注射液。

2.急性心肌缺血模型的建立：腹腔注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉大鼠。连接PowerLab电生理记录仪(澳大利亚埃德仪器有限公司)记录Ⅱ导联心电图。在第3～4气管软骨环间气管插管，连接小动物呼吸机(安徽正华生物仪器设备有限公司)。右侧颈总动脉插管记录动脉血压。胸骨左缘第3～4肋间开胸，在左心耳和肺动脉圆锥间用6-0缝线结扎冠状动脉左前降支。心电图ST段明显抬高并持续，左心室结扎处以下心肌苍白、收缩运动减弱，表明结扎成功。假手术组只穿线不结扎。

3.去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)测定：缺血后15min于颈静脉采血，室温3000r/min离心15min，取上层清液于-80℃冰箱中保存。按NE ELISA试剂盒(ELK7885，武汉科鹿生物科技有限公司)说明检测NE水平。

4.记录室性心律失常发生情况：记录缺血后1h室性心律失常发生情况，包括室性期前收缩个数(单联和二联)、室性心动过速的次数及时长(三联及以上)和每组心室颤动发生率。

5.心率变异性分析：于基础状态和缺血后15min选择5min平稳心电图分析心率变异性，应用LabChart8软件分析以下变量：低频成分(low-frequency component，LF，0.20～0.75Hz)，高频成分(high-frequency component，HF，0.75～2.50Hz)，LF/HF值。

6.电生理检测：(1)有效不应期(effective refractory period，ERP)：自制Ag-AgCl电极于左心室基底部记录单向动作电位，刺激电极置于心室缺血区和非缺血区。采用PowerLab系统S1S2刺激程序(8个连续S1刺激后发放单个S2刺激)，初始S1S1=150ms、S1S2=120ms，以10ms递减至S2不能起搏夺获心室，再以1ms递减，S2脱落前最大S1S2为ERP。(2)动作电位时程(action potential duration，APD)电交替：刺激电极于左心耳给予S1S1刺激(强度为2倍舒张期起搏阈值，脉宽2ms)，单向动作电位电极置于心室缺血区，初始S1S1=300ms，以10ms递减至出现电交替。应用LabChart8软件计算单向动作电位复级至90%的时程(APD90)，10个连续APD90间差异均>5%并伴APD幅值交替性变化，即为APD电交替[8]。(3)心室颤动阈值：刺激电极于右心室施加刺激(频率50Hz，脉宽4ms)，单次刺激5s，间隔2s，初始电压4V，1V递增，诱发心室颤动的最低电压为心室颤动阈值。

7.环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)测定：实验结束后取缺血区心肌和左侧星状神经节，保存于-80℃冰箱中，按大鼠cGMP ELISA试剂盒(H163，南京建成生物工程研究所)说明检测cGMP水平。

结 果

1.大鼠基本情况：模型组大鼠于术中死亡1只，假手术组和CNP组大鼠均无死亡。

2.心率和血压的变化：与假手术组比较，模型组急性心肌缺血15min后心率有增加趋势，收缩压有下降趋势，差异无统计学意义，舒张压明显下降。与模型组比较，CNP组大鼠心率和舒张压均显著降低(表1)。

表1 3组大鼠的心率和血压

3.室性心律失常发生情况：与假手术组比较，模型组室性心律失常事件明显增多，室性期前收缩，主要发生在缺血前30min内。与模型组比较，CNP组室性期前收缩发生次数明显降低，而缺血30min后两组室性期前收缩发生率均较低。同时，与模型组比较，CNP组室性心动过速的总时长和发生次数均明显降低，心室颤动发生率显著下降(表2)。

表2 3组大鼠的室性心律失常发生情况

4.心率变异性：与假手术组比较，缺血15min时模型组LF和LF/HF均明显升高，HF降低。与模型组比较，CNP组LF和LF/HF显著降低，HF轻度升高，但差异无统计学意义(表3)。

5.血浆中NE水平：与假手术组比较，模型组缺血后血清中NE水平明显升高。与模型组比较，CNP组显著降低血清NE水平(表3)。

表3 3组大鼠的心率变异性和血浆去甲肾上腺素(NE)水平

6.电生理结果：与假手术组比较，模型组急性心肌缺血大鼠缺血区ERP明显缩短，而非缺血区ERP无明显变化。与模型组比较，CNP延长缺血区ERP，对非缺血区ERP无明显影响。与假手术组比较，模型组APD电交替的起搏周长明显升高，心室颤动阈值显著降低。与模型组相比，CNP组APD电交替的起搏周长下降，心室颤动阈值显著升高(表4)。

表4 3组大鼠的电生理情况

7.cGMP的水平：与假手术组比较，模型组心肌缺血区和左侧星状神经节中cGMP水平均明显降低。与模型组比较，CNP组cGMP水平明显升高(表5)。

讨 论

交感神经系统过度激活是急性心肌缺血后室性心律失常的重要发生机制。儿茶酚胺与心脏β肾上腺素能受体结合，通过G蛋白偶联并激活腺苷酸环化酶，使cGMP合成增加，激活钠、钙、钾等离子通道，导致心脏电活动紊乱，如心肌细胞兴奋性异常，复极异常及心室颤动阈值下降，进而增加室性心律失常的易感性[9，10]。

表5 心肌缺血区和左侧星状神经节(LSG)中cGMP浓度

CNP是利钠肽家族中的一员，与NPR-B或NPR-C结合后激活鸟苷酸环化酶，升高下游第二信使cGMP的浓度，参与各种生理过程调控[11,12]。心肌缺血后心肌组织中cGMP水平降低，可能与缺血后心肌组织中一氧化氮显著减少有关[13]。近年来研究发现，CNP还可通过抑制交感神经末梢递质的释放，降低交感神经活性，进而发挥其在心血管疾病中的保护作用[7]。本实验结果显示，CNP干预可以明显提高心肌组织和星状神经节组织中cGMP水平，并减少急性心肌缺血后大鼠室性心律失常的发生。急性心肌缺血后室性心律失常多由心室折返引起，表现为缺血区心肌激动延迟诱发的折返[14]。

心肌缺血时，由于心脏各部位缺血程度不一致，ERP呈现不同程度缩短，本研究显示，CNP可延长心室缺血区ERP[15]。APD电交替是指快频率刺激下相邻2个APD复极时间呈现长短交替的现象，与细胞内Ca2+信号紊乱有关，被认为是预测恶性心律失常发生的指标[16]。急性心肌缺血后，APD电交替阈值增大，心律失常发生率增加，而CNP可降低APD电交替阈值，同时减少室性心律失常的发生[17]。心室颤动阈值是反映心肌电稳定性及心室易颤性的重要指标，心肌缺血后心肌电稳定性降低，心室颤动阈值明显降低，CNP可提高心室颤动阈值，降低心室颤动的发生率[18,19]。本实验结果提示，激活 CNP-NPR-B-cGMP通路可能通过抑制交感神经活性减少急性心肌缺血后室性心律失常的发生。

心率变异性反映心脏交感神经和迷走神经的活性及平衡关系[20]。本实验采用频域分析法分析指标包括LF、HF及LF/HF[21]。LF反映交感神经和迷走神经的双重影响，主要以交感神经为主；HF反映迷走神经的张力；LF/HF反映交感神经和迷走神经的平衡关系[22]。心肌缺血15min时，模型组NE释放增加，LF和LF/HF明显增大，HF减小，表明心肌缺血使心脏交感神经张力增强，迷走神经张力减弱，心脏自主神经调控系统失衡。CNP干预显著降低血清NE水平、LF和LF/HF，而HF无明显变化，推测CNP可能主要作用于心脏交感神经，降低交感神经张力，缓解交感神经和迷走神经的不平衡。

本研究为预防急性心肌缺血引起的恶性室性心律失常和心源性猝死提供了新思路，但仍存在局限性：实验仅观察CNP对急性心肌缺血大鼠的影响，未评估CNP对心脏电生理和自主神经平衡的慢性影响；此外，本研究未评估CNP发挥作用的最佳剂量。

总之，本研究结果显示静脉应用CNP可显著抑制心脏交感神经系统激活，从而对心肌缺血后室性心律失常发挥保护作用。