Transgelin基因在主动脉壁中异常表达对主动脉夹层的影响

郭 娴 蒋丁胜 魏 翔 陈 军

主动脉夹层(aortic dissection，AD)是致死率极高的心血管危重疾病，系主动脉内膜破裂，血液进入主动脉管壁内使中膜发生分离，并沿主动脉长轴方向延伸形成真、假腔分离结构。主动脉夹层号称“人体的定时炸弹”，一旦主动脉壁外膜破裂，血液瞬间涌出，患者几乎无挽救可能。据世界卫生组织不完全统计，主动脉夹层发生率约6例/(10万人·年)，因主动脉夹层或主动脉瘤病死率由1999年的2.49例/10万人上升至2010年的2.78例/10万人[1]。主动脉壁由外膜、中膜、内膜3部分构成。主动脉中层囊性退变(包含弹性蛋白断裂和平滑肌细胞减少)、纤维化、动脉粥样硬化斑块形成以及炎性浸润是主动脉夹层的病理基础[2]。其中，平滑肌细胞减少和胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解导致中膜退化是主动脉夹层最经典的特征之一，提示平滑肌细胞稳态和ECM的动态平衡是影响主动脉夹层发生的重要因素[3]。

平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)是主动脉中层的主要组分，约占整个主动脉壁结构的35%，它在维持血管壁稳态中发挥重要作用[4]。SMC表型转化，是影响血管壁稳态的重要因素之一，在血管损伤修复过程中发挥重要作用[5]。SMC有分化型(收缩型)和去分化型(合成型)，两种表型之间可相互转化。生理状态下，大部分SMC为收缩表型，维持血管弹性和机械应力；而在病理状态下，SMC细胞由收缩型向合成型转化，血管壁收缩功能异常、弹性变差、抗扩张能力下降。有文献报道，大多数类型细胞的增殖、迁移、凋亡进程受到改变细胞骨架肌动蛋白结构或张力产生相关因子的调控[6]。

Transgelin编码SM22(smooth muscle 22)蛋白，是平滑肌细胞骨架肌动蛋白结合蛋白，属于钙调节蛋白家族，它是SMC收缩表型的标志分子。Transgelin在体内和体外均能与细胞骨架肌动蛋白结合，通过调节收缩纤丝蛋白使SMC展现出分化/收缩表型[2]。尽管Transgelin基因对SMC细胞功能的调控已有部分文献报道，但Transgelin在主动脉夹层中的作用尚不明确。鉴于SMC对主动脉夹层的发生、发展至关重要，而Transgelin对SMC的功能具有重要的调节作用，提示 Transgelin可能通过调控血管平滑肌细胞(vessel smooth muscle cell, VSMC)的表型转化，从而影响主动脉夹层的发生、发展。本研究检测了Transgelin在TAAD患者主动脉壁中的表达，分析其表达水平与夹层主动脉血管壁直径的相关性，确定Transgelin在主动脉夹层血管壁中的表达模式，探讨Transgelin作为辅助诊断主动脉夹层的临床应用价值。

材料与方法

1.主动脉壁来源：13例夹层主动脉壁均取自经CT血管成像造影(CTA)明确诊断为A型主动脉夹层(TAAD)患者；11例无夹层主动脉壁来自扩心病或冠心病患者心脏移植受体，合并马方综合征、创伤性或医源性主动脉夹层、肿瘤、免疫系统疾病等均不纳入本研究，以上手术均在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。本实验涉及到临床标本采集以及病患病史资料调研均获得患者或家属的知情同意，并经华中科技大学同济医学院附属同济医院医学伦理学委员会审批同意。

2.主动脉直径测量：在TAAD患者CTA中分别测量气管分叉处升主动脉、主动脉弓、降主动脉的峰值以及腹腔干处主动脉直径最大值[7]。

3.组织病理分析：主动脉壁经手术切除后经冷0.9%氯化钠注射液冲洗后，迅速置于4%中性甲醛溶液中进行固定。充分固定后的组织，经脱水、石蜡包埋、切片后，按照标准流程进行苏木精-伊红(HE)染色、EVG染色和免疫组化(IHC)染色[8, 9]。染色结果通过奥林巴斯光学显微镜BX53成像系统拍摄图片。

4.总RNA提取以及反转录-荧光定量PCR分析：称取约50mg主动脉壁组织，用Trizol法提取总RNA, 根据反转录试剂盒说明书采用两步法将mRNA反转录成cDNA，再用SYBR®Green Supermix扩增检测Transgelin基因表达变化。以18S作为内参，引物序列如下：18S正向引物：5′-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3′,反向引物：5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′;Transgelin正向引物：5′-GCAGTCCAAAATCGAGAAGAAG-3′,反向引物：5′-CAGAATCACGCCATTCTTCAG-3′。

5.蛋白质免疫印迹(Western blot)法: 称取约50mg主动脉壁组织用液氮研磨成粉末状，加入300μl含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA强裂解液，用匀浆仪低温匀浆。后续步骤参照文献[8]。根据总蛋白免染胶结果归一化分析，计算统计学差异。

结 果

1.临床资料：入选患者的临床资料见表1，主动脉夹层患者和对照组之间的临床基本资料差异无统计学意义，两组间具有可比性。主动脉夹层患者均经CTA明确诊断为Stanford A型主动脉夹层，CTA结果可见夹层累及部位包括升主动脉、主动脉弓部、降主动脉(图1)。

表1 主动脉夹层患者与对照组临床资料对比

图1 主动脉夹层患者CT血管成像造影以及三维重建图像A.主动脉弓部；B.升主动脉和降主动脉；C.侧位图；D.三维重建侧位图

2.组织病理染色结果：HE染色结果显示对照组主动脉壁中层弹性纤维、胶原纤维以及平滑肌细胞排布紧密有序，而主动脉夹层组结构分布较为乱序，并有明显的红细胞浸润。EVG染色结果表明，对照组主动脉壁中弹性纤维形态完整、连续，而主动脉夹层组主动脉壁弹力纤维断裂明显并伴有量的减少(图2)。

3.Transgelin基因在主动脉壁组织中的分子水平检测：通过实时荧光定量PCR检测Transgelin在主动脉壁中的mRNA表达水平，结果显示，与对照组比较，Transgelin的mRNA水平在主动脉夹层患者中有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05,图3)。进一步通过Western blot法检测Transgelin的蛋白表达水平，结果显示，主动脉夹层患者主动脉壁中的Transgelin蛋白水平明显较对照组高，且差异有统计学意义(P<0.05,图4)。免疫组化进一步研究Transgelin在主动脉壁细胞中的表达及亚细胞定位情况，对照组主动脉壁中仅有少量Transgelin的表达，而Transgelin在主动脉夹层患者主动脉壁中表达量显著升高，且Transgelin主要定位于细胞质中(图5)。

图2 对照和主动脉夹层主动脉壁HE染色及EVG染色结果

图3 Transgelin基因在主动脉壁中mRNA变化

图4 Transgelin编码的SM22蛋白在主动脉壁中蛋白变化(A)以及相对定量结果(B)

4.Transgelin基因表达与主动脉夹层发生的相关性分析：笔者将Transgelin的mRNA表达量与主动脉夹层患者的主动脉直径进行Pearson相关性分析，结果显示， Transgelin的表达与主动脉夹层患者的升主动脉和主动脉弓部直径扩张无显著相关性(图6)。

图5 Transgelin编码的SM22蛋白在主动脉壁中的表达和亚细胞定位情况(A)以及免疫组化阳性率定量结果(B)

图6 主动脉夹层患者主动脉直径与Transgelin mRNA表达量的相关性分析A.升主动脉；B.主动脉弓部

讨 论

平滑肌细胞是主动脉中膜重要的组成部分，其功能(表型转化、迁移、炎症、自噬、增殖、死亡等)紊乱与主动脉夹层发生密切相关[9～13]。已有文献报道Transgelin基因编码的SM22蛋白在平滑肌细胞稳态中发挥重要作用。如SM22能抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖,促进收缩型VSMC迁移，抑制合成型VSMC细胞迁移，显示出两种不同细胞表型的调控模式[5,14]。本研究中笔者发现Transgelin在主动脉夹层患者主动脉壁中表达显著升高，提示可能在主动脉夹层发生过程中由于平滑肌细胞的减少，存活的平滑肌细胞为了代偿其功能，会进一步增加收缩蛋白Transgelin的表达，以期维持主动脉壁的正常功能。

此外，有研究报道在VSMC中过表达SM22能抑制促炎性细胞因子淋巴毒素，刺激介导的NF-κB炎症信号通路激活[15]。在动脉损伤模型中SM22基因敲除小鼠体内线粒体和NAPDH氧化酶活性增强导致活性氧增多, 炎症基因表达上调[16]。以上研究提示SM22不仅与VSMC的增殖、迁移相关，还参与VSMC以及主动脉壁中的炎性反应。众所周知，炎性反应对主动脉夹层的发生、发展至关重要，其不仅参与主动脉夹层的起始，且与主动脉夹层的进一步发展乃至夹层破裂均密不可分[17]。尽管SM22可参与VSMC中炎性反应的调节，但其并不是主要的炎症调控分子。因此，虽然Transgelin在夹层患者主动脉壁中代偿性的升高，但其可能并不足以逆转主动脉夹层患者的炎性反应。

本研究结果发现，主动脉夹层患者中Transgelin的mRNA水平虽有升高，但差异无统计学意义，而其蛋白水平则显著上调，说明Transgelin蛋白水平的升高不仅与转录激活有关，可能还与其蛋白质稳定性相关。此外，由于本研究纳入的样本偏少，而由于遗传背景、用药品种以及时间不同，导致临床样本之间的差异又较大，最终导致其mRNA和蛋白水平统计学上的差异。将Transgelin的mRNA表达量与夹层患者的主动脉直径进行相关性分析发现Transgelin的表达与主动脉直径并无明显的相关性，提示Transgelin可能并不参与主动脉病变的进展，而只是与主动脉夹层的发生相关。然而，Transgelin对主动脉夹层的发生、发展有何影响，何种机制参与其中？以上问题还需通过更深入的动物实验进行探讨。本研究结果为将来的研究提供了一定的基础，且提示Transgelin有望成为辅助诊断主动脉夹层的生物学标志物。