长链非编码RNA CCAT1调控MAPK信号通路对于胶质瘤细胞的影响

王春辉，孟繁凯，费邵阳，陈 莫，郑林杰

(吉林省人民医院 神经外科，吉林 长春130021)

神经胶质瘤(glioma)是脑神经系统最为常见的恶性肿瘤，预后极差，复发率高、死亡率高[1]。寻找有效的胶质瘤诊断和治疗分子靶点，提升治疗效率一直是研究者关注的热点，长链非编码RNA( lncRNA)是人类转录组中一类重要的调控分子，近年来的研究表明lncRNA的异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，然而与神经胶质瘤相关的lncRNA报道仍然较为有限。结肠癌相关转移因子-1(CCAT1),具有2628对碱基，位于染色体8q24.21上，2012年，首次被发现在大肠癌中特异性高表达[2]，随后的研究表明，其在肝癌、胃癌等消化道肿瘤中表达明显升高，并与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭有着密切关联[3,4]，近年来的研究证明CCAT1在脑神经胶质瘤中也存在异常表达，而相关机制仍然有待阐明。因此本研究以神经胶质瘤细胞U251为研究对象，通过下调lncRNA-CCAT1的表达，以探讨其在胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的作用，并分析其对MAPK信号通路相关分子的影响，以其为CCAT1应用于胶质瘤诊断和治疗提供数据支撑。

1 材料及方法

1.1 实验材料

人神经胶质细胞瘤细胞U251(源于多形性胶质母细胞瘤细胞WHO IV级)购自中国科学院上海细胞库。RPMI1640培养液购于美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素/链霉素购自美国Sigma公司；BCA蛋白浓度定量试剂盒、ECL显色试剂盒、相关抗体(磷酸化的ERK1/2单抗、ERK1/2单抗、p38单抗、磷酸化的p38单抗、JNK单抗、磷酸化的JNK单抗、HRP标记的山羊抗兔二抗)及MTT试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；Trizol购于美国Invitrogen公司；Lipofectamine2000脂质体转染试剂购于美国Invitrogen公司；SYBRGreen qPCR检测试剂盒购于日本Takara公司； CCAT1 shRNA(5’-CACCAGCCGGATTAAAT CGTTAGGCCGACCTAC-

TTAAGGCCTTCTTCG-3’)；阴性对照sh-NC(5’-AGGTCCCTACGTTTAACCCCCTATTGGACTA-

CGGAATTTTTCG-3’)均订购自上海生工公司。

1.2 细胞培养及转染

细胞用1640培养基(含10%胎牛血清)，37℃、5% CO2培养箱中培养、传代。转染前24 h，接种在六孔板中，每孔(0.5-2)×105个细胞，待细胞融合度为60%-80%。转染过程参照lipofectamine 2000说明书进行。将细胞分为sh-CCAT1组、sh-NC组、空白组。转染后置于37℃培养6小时后，继续更换为10%血清的培养液继续培养，转染48 h后收集细胞，进行下一步的检测。

1.3 qRT-PCR方法验证敲低U251细胞lncRNA-CCAT1效率

转染48 h后的细胞总mRNA用Trizol法提取，mRNA的纯度用Nanodrop测定，将提取的mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，参照qRT-PCR试剂盒说明配置反应体系及条件，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt方法计算各组lncRNA-CCAT1的mRNA相对表达量。重复3次。lnc-CCAT1检测引物5’-GCATCCTTAGTACTCACTG-3’,5’-GGCCATCTCCTGCTGTTAG-3’。

1.4 MMT法检测细胞增殖变化

将不同组的U251细胞分别接种到96孔板，接种浓度为4×103个/孔，转染24小时、48小时、72小时、96小时后，分别取6个复孔细胞加入MTT试剂20 μl，37℃培养4 h后，加入DMSO 100 μl，振荡反应10 min后，利用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值(A值)。

1.5 细胞划痕试验

将三组细胞消化接种到新的6孔板，次日细胞长满后，采用10 μl 移液器枪头在6 孔板底部进行划痕，采用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，去除脱落细胞，培养箱内培养24 h后，采用倒置显微镜观察划痕愈合情况并拍照。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.6 Western blot 试验

收集转染48 h后的各组U251细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每个样品取40 μg上样，SDS-PAGE电泳后，将蛋白转到PVDF膜上，室温封闭1小时，分别加入相应的蛋白抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL发光液显色，利用Image J分析各条带灰度值，以GAPDH为内参，计算各组条带的蛋白相对表达量。

1.7 统计学分析

用SPSS软件进行统计分析，两组间均数比较采用t检验，P<0.05有显著性差异，具有统计学意义。

2 结果

2.1 Sh-CCAT1对U251细胞lncRNA-CCAT1干扰效率的验证

在脑神经胶质瘤细胞U251中，转染sh-CCAT1后，qRT-PCR检测结果显示，sh-CCAT1组lnc- CCAT1的表达(0.31±0.04)显著低于sh-NC组(1.03±0.03)和空白组(1.00±0.11)(均P<0.05),sh-NC组与空白组间无统计学差异。结果表明转染sh-CCAT1可以有效地抑制胶质瘤细胞U251中lncRNA-CCAT1的表达。

2.2 sh-CCAT1对于U251细胞增殖能力的影响

MMT法检测各组细胞活力显示，空白组和sh-NC组在转染U251细胞24-96 h间的细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),而sh-CCAT1转染组，从48 h起细胞活力显著低于空白组，见表1。说明下调lnc RNA-CCAT1可以显著地抑制胶质瘤细胞的增殖，提示lnc RNA-CCAT1有潜力成为抑制胶质瘤的新分子靶点。

表1 MMT法检测sh-CCAT1对于U251细胞增殖能力的影响

2.3 抑制lncRNA-CCAT1对于U251细胞侵袭和迁移能力的影响

利用细胞划痕试验检测转染后各组胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力，结果如图1，划痕试验中，24 h后，sh-CCAT1组的划痕愈合率(31.1±6.3)%明显低于sh-NC(59.78±3.72)%组和空白组(61.1±2.72)%(P<0.05)，而sh-nc组与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明抑制lncRNA-CCAT1的表达可以降低胶质瘤细胞U251的侵袭和迁移能力。

2.4 抑制lnc RNA-CCAT1对于MAPK信号通路相关蛋白的影响

Western blost检测MAPK信号通路相关的关键蛋白，结果如图2所示，下调lncRNA-CCAT1之后，而ERK、P38、JNK的表达没有明显改变，而p-ERK、p-P38、p-JNK则受到显著抑制，说明lncRNA-CCAT1 抑制了这些关键蛋白的磷酸化，这提示lncRNA-CCAT1可能通过抑制MAPK信号通路的活化，抑制胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭、迁移。

图1 划痕实验检测三组U251细胞的侵袭和迁移能力

3 讨论

越来越多的研究表明，长链非编码RNA是长度大于200nt的非编码RNA，其在表观遗传调控、细胞周期调控等诸多生命活动中均扮演了重要的角色，几乎参与了生物体所有生理和病理过程，越来越多的临床和实验证据均表明，lncRNA异常表达与人类多种肿瘤的发生密切相关，有潜力成为肿瘤诊断和治疗的关键靶点。其中lnc RNA-CCAT1，最早在结肠癌中被发现特异性高表达，位于人类染色体8q24上，与多种疾病的易感性有关，进一步的研究表明CCAT1与多种肿瘤有关。在胆管癌中，CCAT1的高表达通常意味着较差的预后；在急性髓细胞白血病中，CCAT1正调控miR-490-3p,参与了MAPK信号通路的激活[5]；在胃癌细胞中，CCAT1可以促进肿瘤细胞的增殖，同时被miR-219-1所拮抗[6]；在胶质瘤组织中也发现了CCAT1的高表达，并有研究表明CCAT1与胶质瘤细胞的凋亡相关[7]。我们的研究发现，在胶质瘤细胞U251中，CCAT1可以有效抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，为探讨其中的分子机制，我们选择检测三组细胞中MAPK信号通路相关蛋白的表达情况。

图2 Westen blot分析检测lnc RNA-CCAT1下调对于MAPK信号通路相关蛋白的影响

丝裂原活化蛋白激酶是细胞感受外界信号的重要中介酶体，是由一组可以被多种细胞外界刺激(细胞因子、激素等)所激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号通路是一种高度保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，三种激酶通过逐级磷酸化依次激活将信号向下传递，参与细胞多种生理和病理过程。MAPK级联通路涉及了多种关键信号因子，ERK广泛参与细胞的增殖分化的调控[8]；JNK家族涉及细胞各种应激原诱导的信号转导，参与细胞对温度、压力、辐射等应激反应[9]；p38则是介导炎症、凋亡的关键因子[10,11]。我们的结果表明，在lncRNA-CCAT1被抑制后，MAPK通路中的关键因子，自身表达量未发生明显变化，而其磷酸化被显著抑制，这提示lnc-CCAT1很可能参与了MAPK通路的激活。

综上所述，lnc RNA-CCAT1可以显著抑制胶质瘤细胞U251的增殖和迁移，CCAT1可能是通过影响MAPK信号通路的激活，参与肿瘤细胞的增殖。本研究的成果将有助于理解CCAT1参与肿瘤生物行为的分子机制，为寻找脑神经胶质瘤的诊疗新靶点提供帮助。