PD-L1在卵巢高级别浆液性癌预后中的价值

邓宇鹏，许 娜，娄 彤，刘崇东

(首都医科大学附属北京朝阳医院，北京100020)

为了进一步了解PD-L1和CD8在卵巢癌中的表达情况以及评价其对预后的预测价值，我们建立了近10年来在我院完成初次肿瘤细胞减灭术治疗的卵巢高级别浆液性癌患者的临床病例资料库，进行回顾性分析及随访调查，研究影响卵巢高级别浆液性癌患者预后的相关临床及病理因素。同时制作卵巢高级别浆液性癌患者的病理组织芯片，通过免疫组织化学染色评价相关蛋白在卵巢癌病灶中的定位及表达水平情况，研究PD-L1和CD8在卵巢高级别浆液性癌中是否存在表达差异，同时分析蛋白表达强度与预后是否存在相关性，从而进一步验证PD-L1和CD8是否可以预测卵巢高级别浆液性癌的预后，并为卵巢高级别浆液性癌的PD-1/PD-L1阻断治疗的响应度提供预测价值。

1 材料和方法

1.1 病人来源

选取2010年1月至2019年1月在首都医科大学附属北京朝阳医院经手术治疗的高级别浆液性恶性肿瘤患者及病理资料。病人入选标准：(1) 在首都医科大学附属北京朝阳医院完成手术治疗；(2) 术后病理证实为卵巢高级别浆液性癌；(3) 首次肿瘤减灭术后完成以铂类为基础的规范化化疗；(4) 临床资料完整。其中病理诊断不明确；合并其他类型卵巢良恶性肿瘤或其他器官原发恶性肿瘤；首次肿瘤减灭术术后未接受规范化化疗；临床资料不完整或标本缺失的患者不纳入本项研究。收集患者年龄、是否绝经、术前CA125水平、有无新辅助化疗及化疗方案和疗程、肿瘤细胞减灭术满意度(残留病灶<1 cm、≥1 cm)、病理类型、FIGO 临床分期(采用国际妇产科联盟 FIGO-2014手术-病理分期标准重新分期[1])、有无腹水、腹水或腹腔冲洗液细胞学情况(阴性、阳性)、肿瘤包膜是否完整(包膜完整、术前自发破裂、术中破裂)、有无淋巴结转移、术后化疗方案及疗程、化疗效果(完全缓解、部分缓解、疾病进展、疾病稳定)、有无复发、复发后治疗等信息。治疗后患者随访，前6个月随访每个月1次，后6个月每3个月随访一次，第2-5年每6个月随访1次，然后每1年1次。

1.2 组织芯片制作

取入组病人石蜡包埋组织标本，进行病理复核并调取蜡块，由病理科医师根据切片 HE 染色结果在对应的组织蜡块(供体蜡块)上进行癌灶定位并标记，取样针为直径 1.0 mm，样本间间距 1.0 mm，依据组织来源及病理号顺序设计样本序号排列，记录每个样本在阵列中的具体位置。使用手动式组织微阵列制作仪制作组织芯片，密封后置于 4℃冰箱内长期保存备用。

1.3 免疫组化

取组织芯片切片，用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法检测PD-L1及CD8的表达。兔抗人PD-L1抗体(CST)工作浓度为1:50和小鼠抗人CD8抗体工作浓度为1∶10。染色方法按SP试剂盒说明书进行。

1.4 组织芯片图像扫描及免疫组化染色结果分析

将组织芯片扫描并用软件自动程序进行分析。设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。进而对每个组织点进行识别分析出强阳性，中度阳性，弱阳性及阴性的面积(单位：像素)，阳性的百分比，及最后进行组织化学评分(H-score)。H-score=(无着色肿瘤细胞百分率×0)+(弱着色肿瘤细胞百分率×1)+ (中度着色肿瘤细胞百分率×2)+(强着色肿瘤细胞百分率×3)。计算PD-L1在癌巢和间质中的H-score，以中位数作为临界值，≤中位数为低表达组，>中位数为高表达组。通过计数胞膜上有 CD8 阳性染色的淋巴细胞个数，检测 CD8+ TILs 的浸润情况。

1.5 统计学分析

所有数据均使用 SPSS 25.0 统计软件进行统计分析，应用平均值±标准差、频数等对数据进行统计分析。P<0.05 认为有统计学意义。

(1)PD-L1、CD8表达与卵巢高级别浆液性癌预后的生存分析：采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线(Kaplan-Meier survival analysis)，采用对数秩检验(Log-rank test)比较生存差异。分析PD-L1、CD8在卵巢高级别浆液性癌的不同患者中的表达强度是否与 PFS、OS 相关。

(2)PD-L1、CD8在卵巢高级别浆液性癌中的表达与临床病理特征的相关性分析：采用Spearman秩相关检验分析两种蛋白表达强度/密度高低与临床病理特征的相关性及两者之间的相关性。

(3)PD-L1、CD8及临床病理特征与卵巢高级别浆液性癌预后的多因素分析：将单因素分析中P<0.05的因素纳入多因素回归分析，采用 Cox 比例风险回归模型(Cox regression model)进行两种蛋白及临床病理特征与预后的多因素分析，评估预后因素作用。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果

通过免疫组织化学染色，检测PD-L1和CD8在卵巢高级别浆液性癌中的表达情况。2种蛋白在卵巢高级别浆液性癌中的免疫组织化学染色显微图像和H-score 评分/计数分别见图1、表1和表2。

IJMN示病灶，KLOP示间质。放大倍数：A-D/I-L×200，E-H/M-P×400。

PD-L1 蛋白表达主要定位于卵巢高级别浆液性癌细胞的细胞质和细胞膜。90例卵巢高级别浆液性癌患者的PD-L1染色H-score中位数为37.8(5-82)，以其作为临界值将患者分为PD-L1高表达组和PD-L1低表达组，PD-L1 低表达组的病例为43(47.8%)例，H-score中位数18.2(5-37)，高表达组的病例为47(52.2%)例，H-score中位数55.4(39-82)。90例病理切片的CD8+ TILs的中位数为14.7(2-21)，以其作为临界值将患者分为CD8+ TILs高密度组和CD8+ TILs低密度组；癌巢内 CD8+ TILs 高密度组的病例数为47(52.2%)例，CD8+ TILs计数中位数为16.5(15-21)个/HPF，低密度组病例数为43(47.8%)例，CD8+ TILs计数中位数为13.8(2-14)个/HPF；间质内CD8+TILs的中位数为15.8(2-28)个/HPF 。间质中CD8+ TILs高密度的病例为46(51.1%)例，CD8+ TILs计数中位数19.7(16-28)个/HPF，CD8+ TILs低密度的病例为44(48.9%)例，CD8+ TILs计数中位数14.2(2-15)个/HPF。

2.2 PD-L1、CD8在卵巢高级别浆液性癌中的表达与预后

PD-L1、CD8在卵巢高级别浆液性癌中的表达情况见图1，表达差异的生存曲线见图2、图3，统计学分析结果提示:PD-L1低表达组的患者的5年生存预后均明显高于高表达组(5年OS：77.3% vs 22.7%，P<0.001；5年PFS：56% vs 0%，P<0.001)。PD-L1低表达组和高表达组的总生存期分别为56.54±24.39月、40.19±24.18月，无进展生存期分别为31.74±18.31月、17.29±11.35月。分别计数癌巢和间质内CD8+TILs的数目，癌巢内CD8+TILs高密度组的5年生存预后高于低密度组，但无统计学意义(5年OS：51.4% vs 48.1%，P=0.794；5年PFS：43.3% vs 29.5%，P=0.415)。癌巢内CD8+TILs高密度组和低密度组的总生存期分别为43.32±24.63月、37.35±24.02月，无进展生存期分别为32.85±21.67月、30.53±22.89月。间质内CD8+TILs高低密度对OS、PFS无明显影响(P=0.770、P=0.571)。

表1 PD-L1在卵巢高级别浆液性癌中的H-score

表2 CD8+ TILs在卵巢高级别浆液性癌中的计数

图2 PD-L1、CD8表达差异的OS生存曲线

图3 PD-L1、CD8表达差异的PFS生存曲线

2.3 PD-L1、CD8表达与卵巢高级别浆液性癌患者的临床病理特征的相关性分析

统计分析结果见表3。统计学分析结果提示:PD-L1表达与患者具有恶性肿瘤病史(P=0.017，r=0.251)有相关性，与FIGO分期(P=0.045，rs=0.212)有相关性。癌巢内CD8+TILs的密度与临床病理特征均无明显相关性。癌巢内CD8+TILs的密度与PD-L1表达有负相关性(P=0.038，rs=-0.219)。

2.4 PD-L1、CD8表达与卵巢高级别浆液性癌患者的预后的多因素分析

分别以卵巢高级别浆液性癌复发和患者死亡为因变量，以在单因素分析中具有显著差异的临床病理特征变量及三种蛋白的表达为协变量，采取 Cox 比例风险回归模型分析，用 Wald 检验对变量进行筛选。PFS和OS相关危险因素多因素分析见表4。

其中PFS相关的Cox 比例风险回归统计得到的结果如下：PD-L1表达、肿瘤细胞减灭术满意度、新辅助化疗进入 Cox 模型(P值分别为<0.001、0.001和0.038)。与OS相关的 Cox 比例风险回归统计得到的结果如下：PD-L1表达进入 Cox 模型(P<0.001)。

表3 PD-L1、CD8表达与临床病理特征的相关性分析

表4 PD-L1、CD8表达及临床病理特征与预后的多因素分析

3 讨论

免疫系统具有免疫监视、防御、调控的作用，而免疫逃逸是指通过降低肿瘤细胞的免疫原性来促进肿瘤细胞存活。肿瘤细胞通过表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，使T细胞功能处于抑制状态，从而发生免疫逃逸[2]。TILs是一类浸润到肿瘤细胞中的淋巴细胞，包括B细胞、T细胞、NK细胞等具有特异性杀伤肿瘤功能的细胞[3]。CD8+TILs，又称为细胞毒T细胞，在机体识别抗原后能够对带有相应抗原的细胞发挥特异性杀伤作用，是机体抗肿瘤免疫的核心执行者。正常组织极少表达 PD-L1，与其他恶性肿瘤包括肺癌(50%)、食管癌(44%)、胃癌(42%)、乳腺癌(34%)和肾癌(37%)相比[4-8]，PD-L1在卵巢癌中的表达率最高[9]。然而目前的临床试验中，卵巢癌对PD-L1阻断治疗的响应度并不理想，这提示我们卵巢癌中可能存在其他抗肿瘤免疫的不利因素，如杀伤肿瘤细胞的执行者CD8+TILs的数目/密度，或其他对抗肿瘤免疫具有负调控作用的因子。多项研究表明肿瘤浸润性CD8+TILs的数量越多，即肿瘤组织中的免疫储备力量越多，患者使用PD-L1抗体的治疗反应的预测性更好。这意味着PD-L1和CD8+TILs可以联合预测肿瘤患者对PD-L1阻断治疗的响应度。

Hamanishi[10]等曾报道，该团队检测了70例不同病理类型石蜡包埋的上皮性卵巢癌组织标本，PD-L1高表达的患者预后明显差于低表达者。因卵巢癌不同病理类型的异质性较大，如前述研究中，不同病理类型卵巢癌PD-L1表达有明显差异，80%以上卵巢子宫内膜样腺癌高表达PD-L1，卵巢浆液性癌PD-L1的高表达率约60%，而卵巢黏液性腺癌PD-L1高表达率<10%。因此本研究中仅选用卵巢高级别浆液性癌一种病理类型的病例。

目前已知PD-L1的表达上调方式可能有 2 种，即固有表达及适应性免疫抵抗途径。固有表达指肿瘤细胞的癌基因通路启动了PD-L1表达，这种情况下PD-L1往往在癌细胞呈弥漫性表达[11]。肿瘤细胞PD-L1表达上调的另一种机制是适应性免疫抵抗，干扰素诱导肿瘤细胞反应性高表达PD-L1，PD-L1使表达PD-1的T细胞功能耗竭或无能。此种表达有特征性表现，即PD-L1往往在肿瘤组织T细胞富集区，尤其肿瘤侵袭边缘局限表达或高表达。在本研究中，PD-L1在肿瘤组织中的表达主要为弥漫性表达，局灶性表达较少见。因此，以PD-L1表达H-score评分的中位数作为高低表达的临界值，结果具有可比性。本研究中，PD-L1高表达患者的预后明显差于低表达患者。这表明PD-L1表达与卵巢癌患者的预后存在负相关关系，可能反映了宿主抗肿瘤免疫功能的抑制程度。

此外，本研究在分别分析间质和癌巢内的CD8+TILs密度高低对患者的生存预后的影响时发现，二者对患者生存预后的影响均不显著，即肿瘤中的CD8+TILs密度似乎与患者的生存预后无关。由此可见，单纯的癌巢CD8+TILs密度并不能作为预测卵巢浆液性癌患者预后的指标，其抗肿瘤免疫效应不仅受细胞密度、也受到功能状态的影响。此外本研究中还发现，PD-L1表达与癌巢中CD8+TILs存在明显的负相关关系，这提示PD-L1的表达抑制了抗肿瘤的CD8+TILs在肿瘤组织中的浸润，通过这一方式继续影响其发挥抗肿瘤作用。多因素分析还显示PD-L1高表达是影响患者PFS、OS的独立危险因素，因此明确肿瘤组织PD-L1表达情况具有重要的临床意义。

综上所述，卵巢高级别浆液性癌的肿瘤组织中的PD-L1的表达与患者预后密切相关，是影响患者PFS、OS的独立危险因素；PD-L1表达与癌巢中CD8+TILs存在明显的负相关关系，这提示PD-L1的表达不仅直接影响CD8+TILs细胞发挥免疫效应，还间接抑制了其在肿瘤组织中的浸润，对于影响CD8+TILs功能的因素及相关分子标记物还需进一步研究。因此，重视卵巢癌肿瘤组织中的分子标记物检测有助于评估患者预后。近年来免疫治疗日益成为恶性肿瘤的重要治疗手段，作为一种高度个体化的治疗方案，期待有更深入的基础研究预测患者对免疫治疗的响应度和大规模临床试验来探索抗PD-1/PD-L1免疫治疗在卵巢癌治疗中的价值。