黄芪多糖对高氧致新生大鼠支气管肺发育不良mir-34a/sirt1 轴的影响

2020-10-25丁波李智敏黄建玲

安徽医药 2020年10期

丁波，李智敏，黄建玲

支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia，BPD）是早产儿的一种慢性肺部疾病，肺发育不成熟是该病主要原因之一，肺功能受阻早产儿一般会置于氧环境中一定时间，但置于高氧环境中氧产生的毒素会直接损伤肺部［1］。研究发现，微小RNA-34a（microRNA-34a，mir-34a）/沉默信息调节因子 1（silent information regulator 1，sirt1）轴中 mir-34a 上调可抑制sirt1 蛋白的表达从而加快脑内炎症反应［2］，上调mir-34a可促进过氧化氢引起的细胞氧化应激损伤，下调mir-34a可减缓氧化应激损伤［3］。黄芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS）是中药黄芪主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化药理作用，可降低溃烂性结肠炎中炎性因子水平从而治疗溃烂性结肠炎［4］，还可提高仔猪抗氧化能力改善疾病状况［5］，但其对BPD大鼠肺损伤的作用尚未发现报道。本研究通过构建BPD模型，观察APS对BPD大鼠肺组织中炎症反应、氧化应激反应的影响并探讨其作用机制，旨在揭示其保护BPD 大鼠肺损伤的分子机制。

图1 大鼠建模后肺组织形态学变化（HE×200）图2 免疫组化法检测大鼠建模10、17 d肺组织中沉默信息调节因子1（sirt1）表达比较（HE×400）

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1实验动物将2018年1月至2019年1月参加实验的健康SD大鼠由广州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（粤）-2016-0143，清洁级，出生3 d体质量（9.45±0.25）g。实验动物中心温度（25±1）℃、湿度（60±10）%、12 h 黑暗12 h 光照常规饲养大鼠。所有实验均经本院动物实验伦理委员会批准。

1.1.2试剂与仪器 APS由天津华隆医药保健品有限公司提供，批准文号：Z20040085。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒由武汉百浩天生物科技有限公司提供，货号：C0490。大鼠白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒由碧云天生物科技有限公司提供，货号分别为：PI326、PI522、PT516。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 检测试剂盒由上海纪宁实业有限公司提供，货号分别为：N01762、N06457。一抗sirt1（抗鼠）、内参GADPH（抗鼠）、二抗羊抗鼠由英国abcam 公司提供，货号分别为：ab110304、ab8245、ab150117。RNAisoPlus、cDNA 逆转录试剂盒、2×HiSYBR Green QPCR Mix 由日本Ta-KaRa 公司提供，货号分别为：9108、DRR037A、ARR041A。蛋白裂解液由北京索莱宝科技有限公司提供，货号：R0010。脱脂奶粉由美国BD 公司提供，货号：232100。DAB 显色试剂由上海生工生物工程有限公司提供，货号：PW017。氧箱由美国Shellab 公司提供，切片机由德国Leica 公司提供，光学显微镜由日本Olympus 公司提供，实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪由美国ABI公司提供，蛋白凝胶成像仪由上海Tanon公司提供。

1.2 方法

1.2.1动物造模参照文献中方法建模［6］。将64只出生后3 d SD 大鼠按照随机数字表法分为空白对照组（NC 组）、APS 对照组（APS 组）、高氧诱导BPD 模型组（BPD 组）、APS 治疗 BPD 组（BPD+APS组），每组16 只。NC 组、APS 组大鼠暴露在空气中常规饲养；BPD组、BPD+APS组大鼠置于氧箱中，氧浓度维持在（70±5）%，同时吸收氧箱二氧化碳和水蒸气保持氧箱中压力恒定，其余条件与NC 组、APS组相同。24 h 后APS 组和BPD+APS 组腹腔注射100 mg·kg-1·d-1APS，注射体积100 µL，剂量参考文献［7］，NC 组和BPD 组腹腔注射同体积生理盐水，直至大鼠处死。

1.2.2大鼠体质量变化建模10 d 每组大鼠随机抽取8 只，腹腔注射麻醉大鼠称量体质量。建模17 d再次称量。

1.2.3HE 染色观察肺组织形态学变化大鼠称完体质量后立即处死大鼠，打开胸腔，部分肺组织置于4%多聚甲醛中做HE染色和免疫组化实验，部分肺组织置于4 ℃冰箱做ELISA实验，部分置于-80 ℃冰箱做qRT-PCR 和蛋白免疫印迹（Western blot）实验。固定于4%多聚甲醛中的肺组织过夜后，转至不同浓度乙醇中脱水，二甲苯中透明，石蜡中包埋、冷冻凝固后在切片机上切片。切片制作完成后经脱蜡、复水、染色，再脱水、透明、封片完成HE染色，光学显微镜拍照。

1.2.4ELISA检测大鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α、MDA水平和SOD活性置于4 ℃冰箱肺组织在收样6 h内冰上组织匀浆，5 000 r/min 离心5 min，收集上清液分装置于-20 ℃中待测。严格按照大鼠IL-6、IL-10、TNF-α、SOD、MDA ELISA试剂盒说明书步骤操作。

1.2.5qRT-PCR 检测大鼠肺组织中mir-34a 水平-80 ℃超低温冰箱中每个样品取50 mg 组织，RNAisoPlus 提取肺组织总RNA，cDNA 逆转录试剂盒反转录cDNA，qRT-PCR 仪对mir-34a、内参 U6 扩增。引物序列：mir-34a-F：5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’，mir-34a-R：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG-3’；U6-F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，U6-R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。上样体系：cDNA 1 µL（50 ng/µL），F/R（10 µM）各0.5 µL，2×Mix 10 µL，双蒸水（ddH2O）8.0 µL。反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，45个循环。2-ΔΔCT法计算肺组织中mir-34a表达水平。

1.2.6免疫组化检测大鼠肺组织中sirt1 表达水平变化制作好的切片按1.2.3中HE染色相同方法脱蜡、复水，滴加过氧化氢灭火内源性过氧化氢酶，热修复抗原并加磷酸缓冲液冲洗，5%脱脂奶粉封片20 min，滴加一抗sirt1（1∶1 000）［阴性对照用同型同种鼠免疫球蛋白G（IgG）代替一抗］2 h，滴加二抗20 min后二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染核，盐酸酒精分色，脱水、透明、封片。光学显微镜拍照。免疫组化结果鉴定：胞质中出现黄色或棕色颗粒为阳性。阳性评分由两位病理科医师协商判断。阳性率0%～5%为阴性，6%～10%为弱阳性，11%～25%为阳性，＞26%为强阳性。

1.2.7蛋白质印迹法检测大鼠肺组织中sirt1 蛋白水平-80 ℃超低温冰箱中每个样品取30 mg 肺组织，使用高压灭菌过的手术剪剪碎后，在冰上研磨，每管加1 mL 蛋白裂解液冰上裂解30 min，组织匀浆液10 000 g离心5 min，上清液即为肺组织总蛋白。蛋白定量后聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白质，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜280 mA 60 min 转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；对应加入一抗sirt1（1∶10 000）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）（1∶5 000）4℃孵育过夜；对应加入二抗，室温孵育1 h。DAB显色试剂显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.3 统计学方法SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量数据均用±s表示，组内比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量变化NC 组与 APS 组建模 10、17 d 体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。与NC 组、APS组对比，BPD组建模10、17 d体质量降低（P＜0.05）。与 BPD 组相比，BPD+APS 组建模 17 d 体质量增加（P＜0.05）。见表1。

表1 SD大鼠64只建模10、17 d体质量变化/（g，±s）

注：NC组为空白对照组，APS组为黄芪多糖对照组，BPD组为高氧诱导支气管肺发育不良模型组，BPD+APS组为黄芪多糖治疗支气管肺发育不良组。与NC组相比，aP＜0.05；与APS组相比，bP＜0.05；与BPD组相比，cP＜0.05

组别NC 组APS 组BPD 组BPD+APS 组F 值P 值鼠数16 16 16 16体质量建模10 d 22.17±3.41 22.21±3.19 17.46±2.66ab 20.17±4.32 3.380 0.032建模17 d 50.27±4.65 48.79±4.99 35.75±2.85ab 42.66±3.71c 20.516 0.000

2.2 大鼠肺组织形态学变化建模10、14 d，NC 组与APS 组大鼠肺组织气管和各级支气管结构完整，肺泡排列整齐，无间隔破坏，无炎症细胞浸润现象。BPD 组肺组织结构不完整，肺泡数量减少、体积增大，结构简单化，炎症现象明显。BPD+APS 组肺组织结构较完整，肺泡发育较好，大小均匀，间隔较均匀，炎症细胞浸润现象减少，肺泡结构接近NC组和APS组。见图1。

2.3 大鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α 水平变化建模10、17 d，NC 组和APS 组肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与NC组、APS组相比，BPD组建模10、17 d肺组织中IL-6、TNF-α 表达升高，IL-10 表达降低（P＜0.05）；BPD+APS组建模10 d肺组织中IL-10表达降低，TNF-α表达升高（P＜0.05）。与BPD 组相比，BPD+APS 组建模10、17 d肺组织中IL-6、TNF-α表达降低，IL-10表达升高（P＜0.05）。见表2。

表2 SD大鼠64只建模后肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α水平比较/（ng/L，±s）

注：NC组为空白对照组，APS组为黄芪多糖对照组，BPD组为高氧诱导支气管肺发育不良模型组，BPD+APS组为黄芪多糖治疗支气管肺发育不良组，IL-6为白介素-6，IL-10为白介素-10，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。与NC组相比，aP＜0.05；与APS组相比，bP＜0.05；与BPD组相比，cP＜0.05

组别NC 组APS 组BPD 组BPD+APS 组F 值P 值鼠数16 16 16 16 IL-6建模10 d 143.62±44.62 144.37±48.31 211.32±47.68ab 159.66±39.17c 4.009 0.017建模17 d 137.82±39.21 143.66±42.02 218.66±48.04ab 152.22±31.08c 6.848 0.001 IL-10建模10 d 9.66±2.17 9.43±1.89 3.71±0.67ab 6.67±1.17abc 24.688 0.000建模17 d 9.17±1.75 9.19±1.66 3.42±0.53ab 8.17±1.25c 31.659 0.000 TNF-α建模10 d 276.65±66.05 274.18±57.15 496.52±81.91ab 357.77±65.31abc 18.721 0.000建模17 d 274.69±62.17 285.66±56.85 537.88±64.06ab 317.66±73.22c 29.686 0.000

2.4 大鼠肺组织中SOD 活性和MDA 水平建模10、17 d，NC 组和 APS 组肺组织中 SOD 活性和MDA水平表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与NC 组、APS组相比，BPD组建模10、17 d肺组织中SOD活性降低，MDA 表达升高（P＜0.05）；BPD+APS 组建模10 d 肺组织中 SOD 活性降低，MDA 表达升高，建模17 d 肺组织中SOD 活性降低（P＜0.05）。与BPD 组相比，BPD+APS 组建模 10 d 肺组织中 SOD 活性升高，建模 17 d 肺组织中 SOD 活性升高，MDA 表达降低（P＜0.05）。见表3。

表3 SD大鼠64只建模肺组织中SOD活性和MDA水平比较/±s

注：NC组为空白对照组，APS组为黄芪多糖对照组，BPD组为高氧诱导支气管肺发育不良模型组，BPD+APS组为黄芪多糖治疗支气管肺发育不良组，SOD为超氧化物歧化酶，MDA为丙二醛。与NC组相比，aP＜0.05；与APS组相比，bP＜0.05；与BPD组相比，cP＜0.05

组别NC 组APS 组BPD 组BPD+APS 组F 值P 值例数16 16 16 16 SOD/（U/mg）建模10 d 21.25±3.79 20.96±3.50 11.64±1.94ab 14.32±2.54abc 20.172 0.000建模17 d 23.66±4.05 22.18±4.18 8.96±1.95ab 16.95±3.45abc 28.467 0.000 MDA/（µmol/g）建模10 d 2.32±0.76 2.28±0.64 4.17±1.05ab 3.57±0.59ab 11.576 0.000建模17 d 2.39±0.81 2.47±0.56 4.32±0.95ab 2.86±0.71c 10.839 0.000

2.5 大鼠肺组织中mir-34a 表达水平变化建模10、17 d，NC 组与 APS 组肺组织中 mir-34a 差异无统计学意义（P＞0.05）。与 NC 组、APS 组相比，BPD组、BPD+APS 组肺组织中 mir-34a 表达升高（P＜0.05）；与BPD组相比，BPD+APS组肺组织中mir-34a表达降低（P＜0.05）。见表4。

表4 SD大鼠64只建模10、17 d肺组织中mir-34a表达水平比较/±s

注：NC组为空白对照组，APS组为黄芪多糖对照组，BPD组为高氧诱导支气管肺发育不良模型组，BPD+APS组为黄芪多糖治疗支气管肺发育不良组，mir-34a为微小RNA-34a。与NC组相比，aP＜0.05；与APS组相比，bP＜0.05；与BPD组相比，cP＜0.05

组别NC 组APS 组BPD 组BPD+APS 组F 值P 值例数16 16 16 16 mir-34a建模10 d 1.00±0.12 1.01±0.15 2.38±0.47ab 1.62±0.38abc 33.917 0.000建模17 d 1.08±0.11 1.11±0.13 2.28±0.55ab 1.49±0.29abc 24.038 0.000

2.6 免疫组化法检测大鼠肺组织中sirt1 表达水平变化棕色代表sirt1 阳性，蛋白定位于细胞质。NC组与APS组在建模10、14 d sirt1蛋白阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）。与NC 组、APS 组相比，建模10、14 d BPD组sirt1蛋白阳性表达率降低，BPD+APS 组sirt1 蛋白阳性表达率升高（P＜0.05）。与 BPD 组相比，BPD+APS 组建模 10、14 d sirt1 蛋白阳性表达率升高（P＜0.05）。见图2、表5。

表5 SD大鼠64只建模10、17 d肺组织中sirt1阳性表达率比较/（%，±s）

注：NC组为空白对照组，APS组为黄芪多糖对照组，BPD组为高氧诱导支气管肺发育不良模型组，BPD+APS组为黄芪多糖治疗支气管肺发育不良组，sirt1 为沉默信息调节因子1。与NC 组相比，aP＜0.05；与APS组相比，bP＜0.05；与BPD组相比，cP＜0.05

组别NC组APS组BPD组BPD+APS组F 值P 值例数16 16 16 16 sirt1阳性表达率建模10 d 8.32±1.96 9.17±2.09 4.33±0.31ab 12.51±2.06abc 28.834 0.000建模17 d 28.59±2.66 28.37±2.52 3.68±1.03ab 31.67±2.15abc 283.835 0.000

2.7 蛋白质印迹法检测大鼠肺组织中sirt1 表达水平变化NC组和APS组建模10、14 d肺组织中sirt1蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与NC 组、APS组相比，BPD组建模10、14 d sirt1蛋白表达降低（P＜0.05）。与 BPD 组相比，BPD+APS 组建模 10、14 d sirt1蛋白表达升高（P＜0.05）。见图3、表6。

图3 蛋白质印迹法检测大鼠建模后肺组织中沉默信息调节因子1（sirt1）蛋白表达水平比较

表6 SD大鼠64只建模后肺组织中sirt1蛋白表达水平比较/±s

组别NC 组APS 组BPD 组BPD+APS 组F 值P 值例数16 16 16 16 sirt1建模10 d 1.01±0.25 1.09±0.26 0.11±0.06ab 0.94±0.14c 43.368 0.000建模17 d 0.98±0.24 1.11±0.23 0.15±0.05ab 1.02±0.18c 43.906 0.000

3 讨论

BPD 多发生于早产儿，早产儿出生时体质量低、对氧的依赖性强，目前炎症反应、氧化应激、宫内感染、气压伤等均会导致肺组织损伤和修复异常［8］。研究发现早产儿吸入高浓度氧时会增强肺组织炎症，同时肺组织中出现大量的氧自由基，最终形成BPD［9］，目前尚无确切有效的治疗方法。APS是豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根中经提炼、浓缩制成的，是黄芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗应激、抗衰老、抗肿瘤等作用，在BPD大鼠中可减缓炎症水平从而改善BPD病理状态［10］。本研究发现，建模10、17 d，APS组与NC组结果类似，体质量并未减轻，肺组织气管和各级支气管结构完整，肺泡排列整齐，无间隔破坏，无炎症细胞浸润现象，提示APS 对大鼠安全。建模10、17 d，与 APS 组与 NC 组比较，BPD 组大鼠体质量减轻，肺组织肺泡数量减少、体积增大，结构简单化，炎症现象明显，提示高氧可导致新生大鼠体质量减轻、肺组织结构破坏，表明BPD 大鼠造模成功。与BPD 组比较，BPD+APS 组大鼠体质量增加，肺组织肺泡发育较好，大小均匀，间隔较均匀，炎症细胞浸润现象减少，与 NC 组和 APS 组类似，提示 APS 可缓解BPD造成的大鼠体质量减轻、肺组织结构损伤症状，但具体作用机制尚不清楚。

炎性因子是参与炎症反应的细胞因子，其水平反映机体炎症水平。在炎症反应中，IL-6 能诱导急性炎症反应、IL-10有抗炎作用、TNF-α是出现最早、最重要的炎症介质［11］。研究显示，机械通气可致小鼠肺损伤支气管肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α 水平升高、IL-10 水平降低，加快肺损伤［12］。本研究发现建模 10、17 d，NC 组和 APS 组肺组织中 IL-6、IL-10、TNF-α 表达差异无统计学意义，提示APS 本身不会增强正常大鼠肺组织炎症反应。与NC组、APS组相比，BPD 组建模10、17 d 肺组织中IL-6、TNF-α 表达升高，IL-10表达降低，提示高氧诱导BPD 可提高大鼠肺组织中促炎因子、炎症介质水平，降低抗炎因子水平从而增强机体炎症反应。与BPD 组相比，BPD+APS组建模10、17 d肺组织中IL-6、TNF-α表达降低，IL-10 表达升高，提示APS 治疗可减缓BPD 诱导的大鼠肺组织炎症反应增强现象，减缓疾病进程。

SOD 活性和MDA 水平是最常见的两种氧化应激指标，其水平反映机体氧化应激水平，氧化应激指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，是导致疾病的一个重要因素［13］。SOD 是自由基清除酶，反映抗氧化水平，具有抗炎能力；MDA 是过氧化反应产物，可反应过氧化水平［14］。机械通气致小鼠肺损伤支气管肺泡灌洗液中SOD活性下降、MDA水平升高增强肺损伤［15］。本研究发现建模 10、17 d，NC 组和 APS 组肺组织中SOD活性和MDA水平表达差异无统计学意义，提示APS 不影响正常大鼠肺组织中氧化应激反应。与NC 组、APS 组相比，BPD 组建模 10、17 d 肺组织中SOD 活性降低，MDA 表达升高，提示 BPD 会使机体抗氧化能力降低，氧化水平升高，机体氧化应激反应增强。与BPD组相比，BPD+APS组建模10 d肺组织中SOD活性升高，建模17 d肺组织中SOD活性升高，MDA 表达降低，提示 APS 可缓解 BPD 诱导的氧化应激反应增强现象，缓解疾病进程。

miRNA是一种小分子非编码RNA，活性与其靶基因结合性关系紧密，根据靶基因序列不同，其功能亦差别很大［16］。miR-34a在各种真核生物中广泛存在，被认为是一种抑癌基因，可作用多个靶基因［17］；sirt1 是一种去乙酰化酶，是 mir-34a 的直接靶基因［18］，研究发现sirt1可作为独立影响机制减弱炎症反应、改善氧化应激及线粒体等功能障碍水平［19］。缺氧引起心肌细胞损伤会导致mir-34a上调、sirt1下调，从而加速心肌损伤；复氧后mir-34a下调、sirt1 上调可保护心肌细胞［20］。本研究发现，建模10、17 d，NC组与APS组肺组织中mir-34a、sirt1差异无统计学意义，提示APS 不影响正常大鼠肺组织中mir-34a/sirt1轴水平。与NC组、APS组相比，BPD组mir-34a 表达升高、sirt1 表达降低，提示 BPD 可诱导mir-34a表达升高作用靶基因sirt1降低表达水平，促使炎症反应加剧、氧化应激水平升高。与BPD组相比，BPD+APS 组肺组织中mir-34a表达降低、sirt1表达升高，提示APS 可减缓BPD 诱导的mir-34a 升高、sirt1降低现象，降低mir-34a表达、升高sirt1表达，减弱炎症反应、改善氧化应激，实现对BPD 大鼠肺损伤的保护作用。

综上所述，APS可能通过抑制mir-34a表达促使其靶基因sirt1 上调，从而减缓炎症反应、改善氧化应激状态，减轻肺组织损伤，实现对BPD 大鼠肺组织的保护作用。

（本文图1，2见插图10-1）