miR-145-3p在肝癌中的表达及其对肝癌细胞生长的调控作用

2020-10-24

世界华人消化杂志 2020年17期

叶小荣,王理富,丽水市人民医院创伤急腹症、疝与腹壁外科浙江省丽水市 323000

潘德标,丽水市人民医院肝胆外科浙江省丽水市 323000

0 引言

肝癌是全球第六大常见的恶性肿瘤,且其死亡率在所有恶性肿瘤中排名前三[1].据流行病学统计[2],肝癌患者主要分布在亚洲和非洲;尤其是在我国,由于丙型肝炎和乙型肝炎患者众多,造成肝癌发病率一直居高不下.此外,脂肪肝也具有进展为原发性肝癌的风险[3].证据[4]表明,肝癌的关键调控基因的改变与肝癌的发生、发展和预后相关.因此,迫切需要对肝癌发生发展的关键基因进行研究.

微小RNA (microRNAs,miRNAs)是指一类大约22个核苷酸的内源性非编码小RNA,它们可与靶基因以碱基互补配对模式一一结合,并在转录后水平参与调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[5].研究[5]表明,许多miRNAs在肿瘤的发生和进展中发挥着促癌或抑癌的作用.其中,miR-145-3p在头颈癌、肺癌和胃癌等肿瘤中表达下调,且其可发挥抑癌的作用[6-8].而miR-145-3p在肝癌中的表达和作用并不清楚,因此,本研究旨在调查miR-145-3p在肝癌进展中的作用,以及其对肝癌细胞生长的调控作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料:胎牛血清和MEM培养基购于美国Gbico公司;miScipt II RT试剂盒、miScript SYBR Green PCR试剂盒、miR-145-3p引物和U6引物均购于美国Qiagen公司;Trizol和Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司;miR-145-3p抑制剂(miR-145-3p inhibitor)、miR-145-3p模拟物(miR-145-3p mimic)、miR阴性对照(miR negative control,miR-NC)、pcDNA3.1-4型黏蛋白(mucin4,MUC4)和pcDNA3.1-空载体(pcDNA3.1-vector)购自广州锐博生物科技有限公司;CCK-8细胞增殖计数试剂盒、TUNEL荧光(绿色)检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;MUC4和GAPDH抗体以及二抗购自武汉菲恩生物科技有限公司.

1.1.2 组织样本收集:本研究收集的临床样本来自于2017-09/2018-09间在我院行肿瘤切除术的25例肝癌患者(男女比例:男20例、女5例;年龄:38-63岁,平均年龄51.5岁±4.3岁;T分期:T1期5例、T2期7例、T3期8例、T4期5例;病理分型:肝细胞型22例、胆管细胞型2例、混合细胞型:1例),收集肝癌和癌旁组织样本.本实验获得了所有受试者的知情同意书以及医院伦理委员会的同意和批准.

1.1.3 细胞培养:人肝癌细胞株Hep3B和人正常肝细胞株L-02购自于武汉普诺赛生命科技有限公司,肝癌细胞株Huh7、SMMC-7721和HepG2为本实验室留存.所有细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基培养.

1.2 方法

1.2.1 瞬时转染:按照说明书步骤,使用Lipofectamine 2000转染试剂分别将miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC分别转入Hep3B细胞中,转染剂量为20 nnmol/L.转染48 h后,通过RT-qPCR鉴定转染效率.

1.2.2 CCK-8分析:取已转染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B细胞,种植于96孔板(1×104个/孔),分别培养1-4 d后,按照CCK-8细胞增殖计数试剂盒说明书步骤,用酶标仪检测490 nm波长处吸光度值,并根据标准曲线计算细胞数.

1.2.3 细胞周期分析:取已转染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B细胞,用70%乙醇溶液在4℃下固定过夜,用PBS洗涤细胞2次后,用RNase A (100 μg/mL)和PI (50 μg/mL)孵育细胞30 min.用FACS Canto流式细胞仪(BD Biosciences)测定DNA含量,并通过FACS Diva Software(BD Biosciences)来评估细胞周期谱.

1.2.4 TUNEL分析:取已转染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B细胞,继续培养48 h后,按照TUNEL荧光检测试剂盒说明书步骤,用携带荧光素的dUTP (绿色)和DAPI (绿色)对其进行避光染色.通过荧光显微镜观察细胞凋亡情况.

1.2.5 Western blot分析:取已转染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B细胞,继续培养48 h后,用RIPA提取蛋白,并通过常规Western blot法检测细胞MUC4蛋白的表达,其中MUC4的稀释浓度为1:1000,并以GAPDH为内参,通过Image J软件量化MUC4的相对表达量.

1.2.6 RT-qPCR分析:按照说明书步骤,用Trizol试剂从组织或细胞系中提取的RNA,并通过miScipt II RT 试剂盒对提取的RNA逆转录为cDNA,然后以cDNA为模板混合miR-145-3p引物和U6引物,使用miScript SYBR Green PCR试剂盒通过实时定量PCR仪进行RT-qPCR反应,反应程序设置为95℃预变性5 min,然后进行40个循环(95℃ 5 s,60℃ 30 s).引物序列:miR-145-3p (正向引物:5’-GCGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’,反向引物:5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’);U6(正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’,反向引物:5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’);MUC4 (正向引物:5’-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3,反向引物:5’-ATGGTGCCGTTGTAATTTGTTGT-3’);GAPDH(正向引物:5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’,反向引物:5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’).并以U6作为miR-145-3p的内参,以GAPDH作为MUC4的内参,用2-△△CT法计算目的基因的表达水平.

1.2.7 双荧光素酶报告基因分析:将含有miR-145-3p假定结合位点的MUC4野生型或突变型的3’非翻译区(UTR)克隆到psiCHECK-2载体上.将构建的质粒转入已转染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B细胞中.48 h后,根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书使用Dual-Luciferase Reporter系统评估细胞裂解物中的荧光素酶活性.

1.2.8 共转染分析:取已转染miR-145-3p mimic的Hep3B细胞,用Lipofectamine 2000转染试剂分别将20 nmol/L剂量的pcDNA-vector或pcDNA-MUC4分别转入细胞中.转染48 h后用Western blot鉴定转染效率.取共转成功的细胞,继续培养48 h后,用CCK-8法检测细胞活力,用TUNEL染色法检测细胞凋亡.

统计学处理实验数据采用mean±SD表示,利用SPSS 17.0统计软件进行分析.俩组数据比较采用t检验,多组数据两两比较,采用方差分析后Bonfferoni检验.P＜0.05被认为具有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-145-3p在肝癌中低表达图1A显示,与癌旁组织比较,肝癌组织中miR-145-3p表达水平明显降低(P＜0.01),且随着T分期呈现递减现象.与正常肝细胞系L-02比较,肝癌细胞系中miR-145-3p也呈低表达水平(P＜0.01,图1B).这些结果表明miR-145-3p的表达水平与肝癌之间存在密切的关系.

2.2 过表达miR-145-3p抑制肝癌细胞增殖图2A显示,与miR-NC组比较,miR-145-3p inhibitor组中miR-145-3p表达水平明显降低(P＜0.01),miR-145-3p mimic组中miR-145-3p表达水平明显增加(P＜0.01),说明成功构建了转染细胞.CCK-8细胞计数结果(图2B)显示,与转染miRNC的细胞比较,敲减miR-145-3p的Hep3B细胞生长明显加快(P＜0.01),过表达miR-145-3p的Hep3B细胞生长明显减缓(P＜0.05或P＜0.01);细胞周期检测(图2C和D)结果显示,与转染miR-NC的细胞比较,敲减miR-145-3p的Hep3B细胞中S期比例明显增多(P＜0.01)和G0/G1期比例明显减少(P＜0.01),过表达miR-145-3p的Hep3B细胞中S期比例明显减少(P＜0.01)和G0/G1期比例明显增多(P＜0.01).

图1 miR-145-3p在肝癌组织和肝癌细胞中低表达. A:RT-qPCR检测不同T分期的肝癌组织与癌旁组织中miR-145-3p的表达水平,与癌旁组织比较,bP＜0.01;n=5-8;B:RT-qPCR检测L-02细胞和不同的肝癌细胞中miR-145-3p的表达水平,与L-02细胞比较,dP＜0.01;n=3.

图2 过表达miR-145-3p抑制Hep3B细胞增殖. A:RT-qPCR鉴定miR-145-3p inhibitor/mimic转染效率;B:CCK-8法检测细胞生长;C和D:流式细胞仪法检测细胞周期分布.与miR-NC组比较,aP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.001;n=3.

2.3 过表达miR-145-3p促进肝癌细胞的凋亡 TUNEL法结果(图3)显示,与转染miR-NC的细胞比较,敲减miR-145-3p的Hep3B细胞中TUNEL阳性细胞比例明显减少(P＜0.01),过表达miR-145-3p的Hep3B细胞中TUNEL阳性细胞比例明显增多(P＜0.01).

图3 过表达miR-145-3p抑制肝癌细胞凋亡. A:Hep3B细胞TUNEL染色代表图;B:TUNEL阳性细胞计数百分比的统计数据.与miR-NC组比较,bP＜0.01;n=3.

图4 miR-145-3p直接靶向4型黏蛋白. A:Western blot检测癌旁组织和肝癌组织中4型黏蛋白(mucin4,MUC4)的表达水平;P:癌旁组织;C:癌组织;与癌旁组织组比较,bP＜0.01;n=5;B:Western blot检测L-02细胞和不同的肝癌细胞中MUC4的蛋白表达水平;与L-02细胞比较,dP＜0.01;n=3;C和D:转染 miR-145-3p mimic和miR-145-3p inhibitor后,分别用Western blot和RT-qPCR检测MUC4的蛋白(C)和mRNA(D)表达水平;E:双荧光素酶报告基因分析荧光素酶活性.与miR-NC组比较,fP＜0.01;n=3.MUC4:4型黏蛋白.

图5 过表达4型黏蛋白逆转过表达miR-145-3p对细胞存活的抑制作用. A和B:Western blot检测4型黏蛋白的表达;C:CCK-8法检测细胞活力;D和E:代表性TUNEL染色图和TUNEL阳性细胞计数百分比的统计数据.与miR-145-3p mimic+pCDNA-vector组比较,bP＜0.01;n=3.

2.4 MUC4是miR-145-3p的靶基因 MUC4是miR-145-3p的预测靶基因之一.Western blot结果(图4A和B)显示,在肝癌组织(图4A)和肝癌细胞系(图4B)中MUC4表达明显增加(P＜0.01).进一步检测的结果(图4C和D)显示,与转染miR-NC的细胞比较,过表达miR-145-3p的Hep3B细胞中MUC4蛋白和mRNA表达显著下调(P＜0.01),敲减miR-145-3p的Hep3B细胞中MUC4蛋白和mRNA表达上调(P＜0.01).双荧光素酶报告基因分析结果(图4E)显示,在转染MUC4的野生型Hep3B细胞中,与miR-NC组比较,miR-145-3p mimic组荧光素酶活性显著降低(P＜0.01),而miR-145-3p inhibitor组荧光素酶活性明显增加(P＜0.01).

2.5 过表达MUC4逆转过表达miR-145-3p对细胞存活的抑制作用图5A和B显示,miR-145-3p mimic+pCDNAMUC4转染细胞构建成功.CCK-8细胞计数结果(图5C)显示,与转染miR-145-3p mimic+pCDNA-vector的细胞比较,miR-145-3p mimic+pCDNA-MUC4的Hep3B细胞数明显增加(P＜0.01).TUNEL染色结果(图5D和E)显示,与转染miR-145-3p mimic+pCDNA-vector的细胞比较,miR-145-3p mimic+pCDNA-MUC4的Hep3B细胞的TUNEL阳性细胞数明显减少(P＜0.01).以上结果表明:过表达MUC4能逆转过表达miR-145-3p对细胞存活的抑制作用.

3 讨论

近年来,肝癌的发病率呈高速增长趋势[1,2],而肝癌的治疗效果并不太理想.因此,需要进一步研究肝癌治疗的新策略,而研究肝癌发生与进展机制可为肝癌的治疗策略提供参考依据.

miRNAs在包含肿瘤在内的众多疾病类型中发挥着重大作用.在肝癌中,也已发现许多miRNAs参与调控肝癌发生与进展[9],但miRNAs成员众多,依然有许多miRNAs未得到充分鉴定.miR-145-3p作为miRNAs成员之一,已被证明其在头颈癌、肺癌和胃癌中发挥抑癌作用[6-8].本研究结果也显示,miR-145-3p在肝癌组织和细胞中低表达,且与T分期呈负相关关系,提示,miR-145-3p可能参与肝癌的进展.为证明这一观点,本研究进一步将miR-145-3p mimic或miR-145-3p inhibitor转入Hep3B细胞,发现过表达miR-145-3p能抑制细胞增殖、周期转换和促进凋亡;而敲减miR-145-3p呈相反作用,这些结果说明了,miR-145-3p在肝癌中发挥抑癌作用.

miRNA通过与靶基因的3’UTR区以碱基互补配对方式结合,来达到调节靶基因表达,最终发挥后续生物学作用[5].因此本研究通过靶基因预测软件targetScan 7.2筛选miR-145-3p潜在的靶基因,结果发现miR-145-3p与MUC4的3’UTR (142-148位点)存在潜在的结合序列;且本研究进一步通过点突变与荧光素酶法证明了MUC4是miR-145-3p的靶基因.已有研究表明,MUC4在多种肿瘤细胞中高表达,且其高表达能促进肿瘤细胞增殖与迁移[10,11].因此,本研究进一步检测miR-145-3p对MUC4表达的影响,结果显示miR-145-3p能负调控靶基因MUC4的表达.另外,本研究通过外源性引入MUC4过表达载体,发现过表达MUC4可解除过表达miR-145-3p对细胞存活的抑制作用.以上结果表明,miR-145-3p在肝癌中发挥抑癌作用可能与下调MUC4的表达相关.