circ_0001785与miR-330-5p在结直肠癌中的表达及其生物学意义

赵卫华,温学红,刘娜,天津市中医药大学第二附属医院检验科 天津市 300250

马睿,天津医科大学总医院精准医学实验室 天津市 300052

胡建功,王新峰,天津市中医药大学第二附属医院病理科 天津市300250

马亮,中日友好医院检验科 北京市 100029

0 引言

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是临床常见的消化系统恶性肿瘤之一,其具有高病发率与死亡率,由于肿瘤具有极强的转移能力导致患者预后不良,随着CRC诊断及治疗技术的不断改善,治疗效果提高但患者术后复发率仍未改善,肿瘤相关基因可用于CRC靶向药物治疗,因而寻找CRC治疗靶点成为研究重点[1-3].环状RNA (circular RNA,circRNA)在CRC发生及发展过程中发挥重要调控作用,并可能作为CRC靶向治疗的潜在靶点[4].circ_0001785在乳腺癌中表达水平升高,沉默circ_0001785表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭[5].生物信息学分析显示miR-330-5p可能是circ_0001785的靶基因,miR-330-5p在CRC中的表达水平明显降低,并可能参与CRC发生及发展过程[6].但circ_0001785是否可通过调控miR-330-5p的表达从而发挥作用尚未可知.因此,本研究主要探讨circ_0001785在CRC中的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探究其对miR-330-5p的靶向调控作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料:选取2016-05/2019-05本院收治的80例CRC患者为研究对象,所有患者均经病理证实为CRC,术前均未进行放疗或化疗,其中男50例,女30例,年龄45-70岁,平均年龄66.52岁±6.98岁,收集患者临床病理资料,主要包括肿瘤(tumor node metastasis,TNM)分期、分化程度、淋巴结转移等,所有患者均于术中切除CRC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘5 cm处),放入液氮中,置于-80℃超低温冰箱保存.根据circ_0001785、miR-330-5p表达量的平均值将患者分为circ_0001785高表达组41例、circ_0001785低表达组39例与miR-330-5p高表达组45例、miR-330-5p低表达组35例,观察circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性.

1.1.2 主要试剂:正常结肠上皮细胞NCM460、人CRC细胞SW480购自美国ATCC细胞库;DMEM培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司;Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;反转录与荧光定量检测试剂盒购自日本TaKaRa公司;si-NC、si-circ_0001785、miR-NC、miR-330-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-330-5p购自上海吉玛制药技术有限公司;pcDNA3.1购自上海联迈生物工程有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司;Matrigel基质胶购自美国BD公司;CCK-8检测试剂盒购自上海泽叶生物有限公司;兔抗人MMP-2、MMP-9抗体购自美国CST公司;HRP标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 实验分组:NCM460细胞与SW480细胞常规培养,待细胞生长融合度达到80%时进行传代培养.取对数生长期SW480细胞接种于96孔板(1×104个/孔),参照Lipofectamine2000试剂盒分别将si-NC、si-circ_0001785、si-circ_0001785与anti-miR-NC、sicirc_0001785与anti-miR-330-5p转染至SW480细胞,分别记作si-NC组、si-circ_0001785组、si-circ_0001785+antimiR-NC组、si-circ_0001785+anti-miR-330-5p组.

1.2.2 qRT-PCR检测circ_0001785、miR-330-5p的表达水平:采用Trizol法提取CRC组织、癌旁组织、NCM460细胞、SW480细胞及转染后各组SW480细胞中总RNA,应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度.反转录合成cDNA.circ_0001785正向引物5’-CAGTTTTTGATTGCCCCTCC-3’,反向引物5’-GTGTCGTGGGTCTAGTAACC-3’;miR-330-5p正向引物5’-AGAATCGCTTGAAC CCAGGA-3’,反向引物5’-AACAGGGAGAAGTGAGAGGC-3’;U6正向引物5’-GCTTCGG CAGCACATATACT-3’,反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’;GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’,反向引物5’-GGAAGATGGTGA TGGGATT-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成.PCR扩增反应体系:SYBR Green Master Mix 10 μL,正反向引物0.8 μL,cDNA 2 μL,ddH2O补足体系至20 μL;反应条件:95℃ 2 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共40次循环.circ_0001785以GAPDH为内参,miR-330-5p以U6为内参,采用2-△△Ct法计算circ_0001785、miR-330-5p相对表达量.

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖:取各组SW480细胞接种于96孔板(5×103个/孔),置于培养箱培养24 h,每孔分别加入10 μL CCK-8溶液,继续培养2 h,应用酶标仪检测各孔在波长450 nm处的OD值.

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭:细胞迁移实验:将SW480细胞接种于Transwell小室的上室(3×104个/孔),Transwell小室的下室中加入600 μL含有10%胎牛血清的培养液,置于培养箱继续培养24 h,取出小室,PBS洗涤,分别采用多聚甲醛固定与0.1%结晶紫染液染色,置于显微镜下观察迁移细胞数.细胞侵袭实验:Matrigel基质胶稀释液接种于Transwell小室的上室(40 μL/孔),置于培养箱孵育5 h,后续实验步骤同细胞迁移实验,置于显微镜下观察侵袭细胞数.

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测circ_0001785与miR-330-5p的靶向关系:circinteractome预测显示circ_0001785与miR-330-5p存在结合位点,分别构建野生型载体WTcirc_0001785与突变型载体MUT-circ_0001785,将WTcirc_0001785、MUT-circ_0001785与miR-NC、miR-330-5p mimics共转染至SW480细胞,转染24 h后收集细胞,检测细胞相对荧光素酶活性.

1.2.6 Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达:收集各组SW480细胞,加入500 μL RIPA裂解液提取细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度,蛋白变性,SDS-PAGE分离蛋白,转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,分别加入一抗稀释液(1:1000),4℃孵育过夜,TBST洗涤,分别加入二抗稀释液(1:2000),室温孵育1 h,TBST洗涤,曝光,显影,应用ImageJ软件分析各条带灰度值.

统计学处理采用SPSS 21.0统计学软件分析数据,计量资料以mean±SD表示且均符合正态分布,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析;计数资料用n(%)表示,采用χ2检验;采用Pearson法检测CRC中circ_0001785与miR-330-5p的相关性,以P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 CRC中circ_0001785与miR-330-5p的表达量及其相关性分析 与癌旁组织比较,CRC组织中circ_0001785的表达水平显著升高(P＜0.05),miR-330-5p的表达水平显著降低(P＜0.05),见表1.采用Pearson法检测CRC中circ_0001785与miR-330-5p的相关性,结果显示circ_0001785与miR-330-5p呈负相关(r=-0.985,P＜0.0001),见图1.

2.2 circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性分析 根据circ_0001785、miR-330-5p表达量的平均值将患者分为circ_0001785高表达组41例、circ_0001785低表达组39例与miR-330-5p高表达组45例、miR-330-5p低表达组35例,比较分析circ_0001785、miR-330-5p表达量与CRC患者临床病理参数的相关性,结果显示circ_0001785、miR-330-5p表达量与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P＜0.05),见表2.

2.3 CRC细胞与正常结肠上皮细胞中circ_0001785、miR-330-5p的表达量比较 与NCM460比较,SW480细胞中circ_0001785的表达水平显著升高(P＜0.05),miR-330-5p的表达水平显著降低(P＜0.05),见表3.

2.4 干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的影响 与si-NC组比较,si-circ_0001785组细胞活力显著降低(P＜0.05),迁移及侵袭细胞数显著减少(P＜0.05),MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P＜0.05),见图2、表4.

2.5 circ_0001785靶向调控miR-330-5p circinteractome预测显示circ_0001785与miR-330-5p存在结合位点,见图3.双荧光素酶报告实验结果显示,miR-330-5p过表达可降低野生型载体WT-circ_0001785荧光素酶活性(P＜0.05),而对突变型载体MUT-circ_0001785荧光素酶活性无明显影响(P＞0.05),见表5.与si-NC组比较,si-circ_0001785组miR-330-5p的表达水平显著升高(P＜0.05);与pcDNA组比较,pcDNA-circ_0001785组miR-330-5p的表达水平显著降低(P＜0.05),见表6.

2.6 下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用 与sicirc_0001785+anti-miR-NC组比较,si-circ_0001785+antimiR-330-5p组细胞活力显著升高(P＜0.05),迁移及侵袭细胞数显著增多(P＜0.05),MMP-2、MMP-9蛋白水平显著升高(P＜0.05),见图4、表7.

3 讨论

CRC发病率逐年升高,患者生存率未明显改善,其发病机制较为复杂,研究表明circRNA可充当miRNA的海绵分子从而参与CRC发生及发展过程[7-9].circRNA还可能作为CRC诊断及治疗的潜在靶点[10,11].但circRNA在CRC发生及转移过程中的作用机制尚未完全阐明.

circ_0001785在骨肉瘤中表达水平升高,并可充当miR-1200的海绵分子从而促进骨肉瘤发生及发展[12].circ_0001785在乳腺癌中表达水平升高,并可能作为诊断乳腺癌的生物标志物[13].本研究结果显示CRC组织中circ_0001785的表达水平升高,根据circ_0001785表达量的平均值将患者分为高表达组与低表达组,观察其与患者临床病理参数的相关性,结果显示随着circ_0001785的表达水平升高,患者分化程度降低、淋巴结转移及TNM分期升高,提示circ_0001785在CRC发生及发展过程中可能发挥癌基因作用.同时本研究通过体外细胞实验证实干扰circ_0001785表达可降低细胞活力,减少迁移及侵袭细胞数,提示干扰circ_0001785表达可减弱CRC细胞增殖、迁移及侵袭能力.研究表明MMP-2、MMP-9表达水平升高可通过降解细胞外基质沉积从而促进细胞迁移及侵袭[14].本研究结果显示干扰circ_0001785表达可降低CRC细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平,进一步证实干扰circ_0001785表达可抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭.

表1 结直肠癌中circ_0001785与miR-330-5p的表达量(mean±SD,n =80)

表2 circ_0001785、miR-330-5p表达量与结直肠癌患者临床病理参数的相关性分析(n)

表3 结直肠癌细胞与正常结肠上皮细胞中circ_0001785、miR-330-5p的表达量比较(mean±SD, n=9)

图1 circ_0001785与miR-330-5p的相关性分析.

本研究Pearson法分析显示circ_0001785与miR-330-5p呈负相关.研究表明敲除circ-FARSA可通过调节miR-330-5p/LASP1分子轴而抑制CRC细胞的生长[15].circPTN海绵可调控miR-145-5p/miR-330-5p表达从而促进神经胶质瘤细胞增殖[16].miR-330-5p靶向SPRY2参与肝癌的进展进程[17].沉默LncRNA LEF1-AS1通过充当miR-330-5p的海绵分子从而抑制前列腺癌的发生及发展[18].miR-330-5p通过靶向ITGA5抑制胶质母细胞瘤细胞增殖及侵袭[19].本研究结果显示CRC组织中miR-330-5p的表达水平降低,与上述研究结果相似,进一步分析显示miR-330-5p表达量与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关,提示miR-330-5p在CRC发生及发展过程中发挥重要调控作用.本研究通过双荧光素酶实验与qRT-PCR实验证实circ_0001785可靶向结合miR-330-5p,并可负向调控miR-330-5p的表达.同时本研究将antimiR-330-5p与si-circ_0001785共转染至CRC细胞,结果显示细胞活力升高,迁移及侵袭细胞数增多,MMP-2、MMP-9的表达水平升高,提示下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对CRC细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用.

表4 干扰circ_0001785表达对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的影响(mean±SD,n=9)

表5 双荧光素酶报告实验(mean±SD,n=9)

表6 circ_0001785靶向调控miR-330-5p的表达(mean±SD,n=9)

图2 干扰circ_0001785表达对结直肠癌细胞SW480迁移及侵袭的影响.A:迁移及侵袭图;B:Western blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达.

表7 下调miR-330-5p表达可降低干扰circ_0001785表达对结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用(mean±SD,n=9)

图3 circ_0001785的序列中含有与miR-330-5p互补的核苷酸序列.

图4 Western blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达量.

4 结论

综上所述,干扰circ_0001785表达可通过上调miR-330-5p的表达从而抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭,并可能作用CRC治疗的潜在靶点.但关于其具体作用机制仍需进一步探讨,下一步将进行体内动物实验及检测相关信号通路以期进一步证实circ_0001785与miR-330-5p在CRC发生及发展过程中的作用机制.

文章亮点

实验背景

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发病率逐年上升,由于其临床症状不明显导致大部分患者确诊时已处于中晚期,随着医疗技术的发展,分子靶向治疗成为肿瘤的主要治疗手段,目前CRC发病机制尚未阐明,环状RNA(cular RNA,circRNA)在CRC等肿瘤中表达异常,并可能作为CRC诊断及治疗的潜在靶标.

实验动机

circRNA在肿瘤发生及发展过程中可能发挥癌基因作用,但其在CRC中的研究相对较少,因而积极探寻新型cricRNA并分析其可能作用机制,为阐释CRC发病机制及其治疗提供潜在靶标.

实验目标

干扰circ_0001785表达可通过上调miR-330-5p的表达从而抑制CRC细胞增殖、迁移及侵袭.

实验方法

采用qRT-PCR法检测CRC组织及细胞系中circ_0001785与miR-330-5p的表达量;采用Pearson法分析CRC组织中circ_0001785与miR-330-5p表达量的相关性;观察circ_0001785、miR-330-5p表达量与患者临床病例参数的相关性;体外细胞实验验证circ_0001785、miR-330-5p对细胞增殖、迁移及侵袭的影响,探究二者之间的靶向关系.

实验结果

circ_0001785在CRC组织及细胞系中呈高表达,而miR-330-5p呈低表达,二者呈负相关,其表达量与分化程度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关;体外细胞实验结果显示干扰circ_0001785表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭;circ_0001785可靶向结合miR-330-5p;circ_0001785可通过靶向调控miR-330-5p而发挥作用.

实验结论

干扰circ_0001785表达可负向调控miR-330-5p表达进而减弱CRC细胞增殖、迁移及侵袭能力.

展望前景

关于miR-330-5p如何调控下游靶基因表达及其可能作用机制仍需进一步探究.