HPLC法测定铁甲草中大黄素的含量

赵 莹，黎翠英，苏璐丹，张声源,3，聂 华,3

(1.嘉应学院医学院 客家药用生物资源研究所，广东 梅州 514031；2.江门市蓬江区中西医结合医院，广东 江门 529030；3. 嘉应学院 广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514031)

铁甲草(CassiamimosoidesLinn.)为豆科(Leguminosae)决明属植物含羞草决明的全草，主要分布于广东、福建、台湾、贵州、广西和云南等地，以全草入药，味甘、微苦，性凉，归肝、肾和肺经，具有清热解毒、清肝明目、祛湿、利水、解酒、化积通淋、散疲消痈等功效，可用于湿热黄疽、暑热吐泻，毒蛇咬伤，便秘水肿和痈肿疗疮等的治疗[1]。近年来已有研究表明，铁甲草具有抑制脂肪酶[2]、抑制肝纤维化[3]、保护损伤肝细胞[4]和抗氧化活性[5]的药理作用。此外，国内外学者对其化学成分也进行了研究，发现其含有香草酸、木犀草素、槲皮素、(R)-鹰爪三醇、齐墩果酸、大黄素、胡萝卜苷和β-谷甾醇等[5-6]。但是，对铁甲草药材质量控制方面的研究却很少，亦无对其成分进行定量分析的研究报道。

本文选取铁甲草中具有抗肝癌作用的大黄素[7-8]，作为定量检测指标成分，采用高效液相色谱法，建立铁甲草中大黄素的含量测定方法，为铁甲草质量标准的制定奠定基础，有利于铁甲草的资源培育及潜在经济价值的实现。

1 仪器与材料

Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪(Waters公司)；Waters 2998PDA光电二极管阵列检测器(Waters公司)；Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)； WJX-A1000型高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)；JP-100S型超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；MING-CHE 24UV超纯水机(法国Merck Millipore公司)。

大黄素对照品(批号：110756-201512)，购于中国药品生物制品检定研究院；铁甲草采于广东省梅州市蕉岭县，经嘉应学院医学院生药学翟明老师鉴定为豆科决明属植物铁甲草(Cassiamimosoides)的全草；其他试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 对照品溶液的制备

称取1.00 mg的大黄素标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制得0.1 mg/mL的大黄素对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

称取铁甲草粗粉2.00 g，药材中加入2 mol/L的盐酸10 mL，充分浸润后，60℃水浴2 h进行酸水解，滤渣用超纯水水洗至中性，烘箱干燥。药材干燥处理后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，使乙醇溶液pH值=8，于50℃下超声30 min，放置至室温，补足损失的质量，抽滤得样品滤液，水浴浓缩成浸膏。

浸膏用甲醇进行超声溶解，离心处理后，取上清液定容至10 mL，溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液注入液相瓶中，制备成供试品溶液以备进样。

2.3 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge® Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相∶甲醇∶0.1%甲酸=85∶15；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL，柱温：35℃。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.1”项下的大黄素对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为5，10，20，30，40，50 μg/mL系列浓度的大黄素对照品溶液，于“2.3”项的色谱条件下，以大黄素对照品溶液色谱峰面积Y为纵坐标，大黄素对照品浓度 X(μg/mL)为横坐标，进行线性拟合，得大黄素标准曲线，求得回归方程为Y=38315X-16555，R2=0.9994，结果表明，在5～50 μg/mL的浓度范围内，大黄素对照品溶液的峰面积与浓度的线性关系良好，结果见图1。

图1 大黄素标准曲线

2.5 专属性考察

取项目“2.1”和“2.2”所制备的对照品溶液和供试品溶液，在“2.3”的色谱条件下进样，大黄素的保留时间为6.19 min左右，峰型稳定，分离度良好，有较好的基线分离，未见杂质峰干扰，具有良好的专属性。

2.6 仪器精密度试验

表1 精密度试验结果

精密吸取对照品溶液1.0 mL，于“2.3”的色谱条件下，连续重复进样6次，每次10 μL，检测得到大黄素峰面积的RSD为0.81% ，表明仪器精密度良好，结果见表1。

2.7 样品稳定性试验

精密吸取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h于“2.3”色谱条件下，检测大黄素的峰面积，得RSD为1.65% ，表明供试品溶液在12 h内稳定，结果见表2。

表2 稳定性试验结果

2.8 样品重复性试验

称取6份等质量的铁甲草粗粉2.00 g，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，于“2.3”项色谱条件下，检测得大黄素峰面积的RSD为1.42%，表明该方法重复性良好，结果见表3。

表3 重复性试验结果

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的等质量铁甲草粗粉6份，每份2.00 g，分别精密加入同一浓度的大黄素黄素对照品，按上述“2.2”的提取方法平行制备成供试品溶液，于“2.3”项色谱条件下测定，计算得到平均回收率结果为98.94%，RSD为1.98%。表明该方法测得的结果有良好准确性，结果见表4。

表4 加样回收率试验结果(n=6)

2.10 样品含量测定

表5 铁甲草中大黄素含量测定结果(n=3)

精密称取3份不同批样品，按照“2.2”项的制备方法制备成供试品溶液，每份样品分别在“2.3”项的色谱条件下进样三次，记录峰面积，计算样品中大黄素的含量，结果见表5。

3 讨论

采用已有报道的铁甲草的提取方法[9]进行提取，发现经HPLC检测时，结果不理想，考虑到大黄素为弱酸性成分，以游离形态或结合形态存在，易与钠、钾、钙、镁等金属离子结合成盐存于植物体内，因此，本实验将铁甲草提取方法进行改进，在溶剂提取前进行酸水解处理，利于大黄素以游离形式存在；考虑到硫酸的氧化性容易使药材在水解过程中产生碳化反应，造成药材的损失，故选择盐酸作为水解介质。并且，在考察大黄素的色谱条件时发现，在流动相中加入适量酸能够抑制成分解离，使峰型更稳定、分离度更好且出峰时间适宜。

大黄素具有保肝护肝作用，有助于改善肝损伤，与铁甲草的功效相吻合，同时，大黄素也是中药材常用的检测指标成分。本研究建立的铁甲草中大黄素的含量检测方法，精密度高，稳定性、重复性、加样回收率均良好，操作简便，测得铁甲草含量在0.026%～0.032%，重现性较好，可为铁甲草含量测定和质量评估提供参考依据。