不同类型心脏停搏液对小鼠未成熟心肌细胞增殖能力的影响

刘怀普，梁彦锴，吴柯叶，郑丰楠，谭小莉，孟保英

心内直视手术过程中，由于缺血／再灌注损伤、溶血、中性粒细胞活化等因素的影响，会产生大量的活性氧，未成熟心肌细胞在结构、代谢和功能方面有明显差别，其更容易受到活性氧的损害［1］。研究表明，生后≤7 d的小鼠和≤3个月的人类心肌细胞具有较强的增殖能力［2－3］，而活性氧造成的DNA损伤，是导致心肌细胞增殖能力下降的关键因素之一［4］。目前用于未成熟心肌细胞保护的心脏停搏液种类繁多，何为最佳方案仍有争议，因此，本研究从细胞增殖的角度，比较不同类型心脏停搏液对小鼠未成熟心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57／BL新生小鼠（生后3 d内），其母鼠购自深圳大学实验动物中心。

1.2 主要试剂和仪器 EdU－488细胞增殖检测试剂盒（BeyoClickTM）、Anti－Rabbit HRP（AB6721）、Anti－Ki－67（AB15580）、0.25% Trypsin－EDTA（GIBCO 25200－026）、FBS（GIBCO 10091－148）、马血清（蕊特生物W9010－05）、DMEM／F12（1∶1）培养基（GIBCO 11320－033）、Collagenase Type II（GIBCO 17101－015）、MTT细胞增殖检测试剂盒（C0009）、倒置荧光显微镜（Olympus IX71）、二氧化碳培养箱（hf151uv Heal Force）、全波长酶标仪（Multiskan GO1 510）等。

1.3 新生小鼠心肌细胞培养 生后3 d内新生C57／BL小鼠10只，以75%乙醇消毒后，固定于无菌台，沿胸骨中线剪开胸腔，迅速切取心脏，至于4℃缓冲液中［20 mmol／L HEPES－NaOH（pH 7.6），130 mmol／L NaCl，1 mmol／L NaH2PO4，4 mmol／L葡萄糖，3 mmol／L KCl］，洗净心腔内血液后，去除心房和大血管组织，将心室组织剪成1～3 mm3大小的碎块，并移入盛有青霉素溶液的无菌瓶中。向无菌瓶加入2 ml 0.08%胰酶－0.1%Ⅱ型胶原酶的1∶1混合液，磁力搅拌消化（转速20～30 r／min，37℃）。首次消化6 min，弃上清，之后每次消化5 min，将消化液转移到15 ml离心管中，其内包含1 ml 20%胎牛血清DMEM－F12培养基，以终止胰酶作用，并于4℃冷藏保存，按照以上步骤，共消化7～8次。然后将上述消化液混合后于离心（1 100 r／min，10 min），弃上清，以含20%胎牛血清和5%马血清的DMEMF12培养基重悬，200目孔径不锈钢网虑除未消化的大块组织。将过滤后的细胞液转移到培养皿中，置于5%CO2、37℃条件下培养，1.5 h后去除尚未贴壁的细胞悬液后，转入另一块培养皿中，继续培养。

1.4 实验分组 将新生小鼠心肌细胞培养48 h后，通过随机数字法分为5组：空白对照组（A组）、复方电解质液组（B组）、改良圣托马斯液（St.Tho⁃ma’s，STH）组（C组）、组氨酸－色氨酸－酮戊二酸盐液（Histidine－Tryptophan－Ketoglutarate solution，HTK）组（D组）以及仿del Nido液组（E组）。其中仿del Nido液以培养基代替血液与晶体按1∶4比例混合。将B、C、D、E四组的培养基分别换成4℃的复方电解质液、改良STH液、HTK液和仿del Nido液，然后将五组细胞在室温培养箱外无菌环境下放置2 h，更换至正常培养基，继续5%CO2、37℃条件下置于培养24～72 h。

1.5 观察指标

1.5.1 5－乙炔基－2’脱氧尿苷（5－Ethynyl－2’－de⁃oxyuridine，EdU）荧光染色 将停搏液处理后的各组心肌细胞更换至正常培养基后，加入预先配制好的EdU溶液，在5%CO2、37℃条件下培养24 h，然后进行细胞固定与Edu染色标记，计数EdU阳性心肌细胞百分比。

1.5.2 Ki－67荧光染色阳性细胞计数 Ki－67是一种与细胞增殖状态相关的核心蛋白，对停搏液干预后继续培养48 h的5组细胞进行Ki－67免疫荧光检测，计数方法为：荧光显微镜40×目镜下随机计数3个视野，计算阳性细胞百分比，其中阳性细胞指有Ki－67阳性产物并有细胞核染色的细胞。

1.5.3 MTT比色法检测心肌细胞增殖 停搏液干预后的五组细胞继续培养24 h、48 h、72 h，采用MTT法检测细胞存活和生长，使用全波长酶标仪（Multiskan GO1 510）在波长570 nm处检测心肌细胞的吸光度值。

1.5.4 Yes相关蛋白1（Yes－associated protein 1，YAP1）表达 YAP1是Hippo信号转导通路下YES相关蛋白，在细胞增殖和分化过程中起关键作用。采用Western Blot技术检测停搏液干预后继续培养48 h的细胞中YAP1蛋白的表达情况。

1.6 统计分析 采用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料采用率的形式表示，组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）方法，方差齐性检验采用Bart⁃lett＇s检验，组间率的比较采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 新生小鼠心肌细胞形态观察 将分离培养48 h后的心肌细胞放置光镜下观察其形态，可见未贴壁心肌细胞为圆形、发亮，已贴壁的心肌细胞伸展为梭形、棒状、星状及分叉状等（见图1）。

图1 光镜下新生小鼠心肌细胞形态（100X）

2.2 EdU荧光染色观察细胞增殖情况 绿色代表增殖细胞核，蓝色代表全部细胞核。与A组相比，B、C、D、E组细胞明显增多（图2）。B、C、D、E组的细胞增殖率明显高于A组（P＜0.001），其中D组最高，C组次之，E组小于B组，即HTK液组＞改良STH液组＞复方电解质液组＞仿del Nido液组＞对照组。见图3。

图2 EdU标记增殖的心肌细胞（200X）

图3 EdU免疫染色阳性心肌细胞百分比

2.3 Ki－67免疫阳性细胞计数 红色代表Ki－67免疫阳性细胞核，蓝色代表全部细胞核，与A组相比，B、C、D、E组细胞明显增多（见图4）。B、C、D、E组的细胞增殖率明显高于A组（P＜0.001），其中D组最高，C组次之，E组小于B组，即HTK液组（15.8%）＞改良STH液组（12.6%）＞复方电解质液组（12.3%）＞仿del Nido液组（9.0%）＞对照组（8.0%）。见图5。

2.4 MTT比色法检测心肌细胞增殖 酶标仪在波长570 nm处检测OD值结果（表1）：D（HTK液）组＞C（改良STH液）组＞E（仿Del Nido液）组＞B（复方电解质液）组＞A（对照）组。

图4 Ki－67标记增殖心肌细胞（200X）

表1 5组心肌细胞OD值结果（n＝18，±s）

表1 5组心肌细胞OD值结果（n＝18，±s）

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2.5 YAP1蛋白表达 采用Western Blot技术检测5组心肌细胞YAP1蛋白的表达水平，用β－actin作为内参对照，D组YAP1蛋白表达高于其他各组，A、B、C和E组间无明显差异（图6）。

3 讨 论

心脏停搏液在先天性心脏病矫治术中的应用已有40多年的历史，其与低温技术相结合，依然是预防心肌缺血／再灌注损伤的主要方法。目前，心脏停搏液的种类繁多，但孰优孰劣仍有争议，且研究内容主要集中于心肌标志物、炎症指标、血管活性药物需求及ICU停留时间等。而研究表明：未成熟心肌不同于成熟心肌，其具有较强的增殖能力［2－3］。故本研究以心肌细胞增殖为观察指标，比较3种常用心脏停搏液对未成熟心肌的保护作用。在本研究中，为比较改良STH液、HTK液和仿del Nido液对新生小鼠心肌细胞增殖能力的影响，采用3种不同的实验方法观察了3种反应细胞增殖能力的指标，最终结果均表明HTK液保护心肌细胞增殖能力最好，改良STH液次之。

图5 Ki－67免疫阳性心肌细胞百分比

图6 心肌细胞YAP1蛋白的表达情况

测量细胞增殖能力最准确的方法是直接测量DNA合成，EdU（5－乙炔基－2’脱氧尿苷）是胸苷的类似物，能在DNA合成过程中加入其中［5］。本研究提示HTK液组DNA合成最为活跃，对照组DNA合成活动最低，证明HTK液组处于增殖状态的心肌细胞比例最高。Ki－67蛋白是一种位于细胞核内的大分子蛋白，是细胞增殖必不可少的非组蛋白，其功能与染色质和细胞有丝分裂有关，是辨认细胞群中增殖细胞的优异标志［6－7］。本研究中Ki－67免疫荧光检查结果与EdU免疫染色结果类似，提示HTK组染色体复制和有丝分裂最活跃，亦证明HTK液组处于增殖状态的心肌细胞比例最高。采用MTT比色法检测细胞增殖，具有灵敏、稳定、准确度高等优点，本研究中随着时间的延长，各组OD值均呈线性上升，其中HTK液组上升幅度最大，对照组曲线相对平直，与前两种方法检测结果不同的是，该法测得的仿del Nido液细胞增殖率明显高于复方电解质液组。

YAP1为一种YES相关蛋白，是Hippo信号转导通路的主要效应物，通过与相关转录因子相互作用，调节细胞增殖［7］。HTK液组YAP1的表达高于其他各组，提示HTK液对心肌增殖能力的保护作用的机制可能与Hippo信号转导通路有关。HTK液成分仿细胞内液，能够使心肌在低钾、低钠、无钙环境下舒张期停搏，以组氨酸／组氨酸盐缓冲对作为酸碱平衡系统，并添加色氨酸和α－酮戊二酸作为能量底物，其被认为是心脏移植手术中器官保存的“金标准”［8－9］。其对未成熟心肌增殖能力保护作用的其他机制可能是：①组氨酸／组氨酸盐缓冲对具有强大的酸碱缓冲能力；②甘露醇和色氨酸能够稳定细胞膜和维持细胞膜渗透压调节；③添加α－酮戊二酸作为底物，能改善高能ATP合成。改良STH液是一种典型的细胞外液型高钾停搏液［10］，其在本研究中对心肌细胞增殖能力的保护作用仅次于HTK液，表明其是一种优良的未成熟心肌晶体停搏液。单纯采用4℃复方电解质液处理，结果亦显示出明显的保护作用，其机制可能与低温对心肌细胞的保护作用有关。del Nido液是公认的优质未成熟心肌停搏液［11］，然而本研究中仿del Nido液组EdU免疫阳性细胞百分比（20.0% vs.22.5%）和Ki－67阳性细胞百分比（9.0%vs.8.0%）均低于复方电解质液组（P＜0.001），可能是本研究中的仿del Nido液与临床使用的正规del Nido液差距较大所致，这也是本研究的局限性之一。

综上所述，HTK液和改良STH液对离体新生小鼠心肌细胞增殖具有明显的保护作用，其中前者的保护作用更优。