农大高诱1号对黔西北玉米不同种质资源单倍体诱导研究

罗希榕，覃 成，李清超，梁振娟，刘建新，杨 珊，宋志豪，蔡向西，张 林

(1.遵义职业技术学院现代农业系，贵州 遵义 563006；2.遵义市农业科学研究院遵义市作物基因资源与种质创制重点实验室，贵州 遵义 563006；3.毕节市农业科学研究所，贵州 毕节 551700)

玉米是人类利用杂种优势最早、最广泛、成效最显著的作物。据FAO公布的数据(http://www.fao.org)，2018年世界玉米种植面积为16 827万hm2，总产量104 050万t，种植面积和产量分列农作物的第二位和第一位；我国玉米年播种面积为3 544.5万hm2，总产量为21 589万t，种植面积和总产量均居农作物的第一位。20世纪70年代后期，我国实现了玉米单交种的普及，大幅度地提高了玉米产量[1]。进而玉米育种家开始大规模利用二环系法等常规育种技术手段选育自交系，以提高玉米杂交种的产量和抗病性。但该方法获得高配合力的纯合自交系通常需要经过6～10代的自交选择。近年来，单倍体育种技术已成为与分子标记辅助育种技术、转基因技术相媲美的现代玉米育种三大核心技术[2-5]。单倍体育种能显著缩短育种年限，一般只需一代自交即可获得纯合自交系。1929年首次发现玉米单倍体[6]，1950年发现玉米单倍体诱导系Stock 6材料[7]，使玉米单倍体育种技术由设想变为现实。我国利用单倍体诱导选系开展较晚[8-10]，但取得了很大的进展。我国育种家对美国学者Coe EH选育的单倍体诱导系Stock 6进行了遗传改良，刘志增等[11,12]将高油玉米群体BHO与单倍体诱导系Stock 6进行杂交，通过对其后代进行测交和选择，育成了农大高诱1号。这是我国第一个玉米孤雌生殖单倍体诱导系，结合了ABP 1紫色植株标记和独特的大胚面标记，与Stock 6相比，其质粒Navajo标记更加明显，平均单倍体诱导率(5.34%)是Stock 6的5倍。

本研究以农大高诱1号作父本，进一步从黔西北玉米不同种质资源中筛选单倍体诱导率较高的合适母本，实现配子选择，提高优良基因型的入选频率，用于选育综合性状好的纯系，组配出更加高产和优质的玉米新品种，为贵州省玉米品种的合理布局提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

孤雌生殖诱导系农大高诱1号由中国农业大学发放，216、405、02 H 58、13 H 199、E 28、木6、S 37、Y 054、Mo 17×B 73、T 32×R 273、W 260×612、毕单17、毕单18、昌7-2、昌7-2×K 12、木6×Mo 17、木6 X 82、齐319×沈137、齐319×18-599、沈137×掖478、地方种、郑58×B 73等参试材料均由毕节市农业科学研究所引进或经过多年的田间选择及构建而来，所有供试材料中的杂交组合均为F3代种质，试验材料包括墨白、兰卡斯特、旅大红骨、塘四平头、苏湾、瑞德、P群以及地方种等种质资源，所有参试材料均种植于毕节市农业科学研究所毕节实验基地。

1.2 试验方法

1.2.1参试材料与试验设计

参试材料父本选用中国农业大学下发农大高诱1号，母本选用国内骨干自交系及毕节市农业科学研究所选育新材料，2013年春季将参试材料在毕节市农业科学研究所实验基地杂交，获得F1代，同年在海南玉米基地自交获得F2代相应材料，2014年在毕节实验基地利用高诱1号作父本进行杂交；自交系材料每个杂交5穗，杂交种每个处理10穗，2次重复。

1.2.2单倍体的诱导

用孤雌生殖诱导系农大高诱1号作父本，以参试材料作母本，杂交诱导单倍体，从收获的杂交种子中鉴定挑选单倍体。

1.2.3遗传标记鉴定

基于R-nj遗传标记系统，以玉米籽粒的紫色糊粉层和紫色胚芽为显性标记。经过孤雌生殖诱导系诱导的玉米籽粒，紫色糊粉层及紫色胚芽的籽粒为正常杂交籽粒，紫色糊粉层加无色胚芽籽粒即为单倍体籽粒，其余籽粒为受花粉污染的正常杂交籽粒。将所选择的准单倍体籽粒精细播种于田间，根据R-nj基因控制的植株颜色鉴定单倍体植株[13]。

1.2.4形态学鉴定

在相同的管理条件下，单倍体植株与正常植株，形态差异较大，单倍体植株矮小，叶片较少、狭窄、直立，生长缓慢；一般正常杂交株株型高大，生活力较强，长势较为旺盛，与一般杂交植株较为相似。将相应单倍体籽粒经过不同的加倍方法加倍处理后在育苗盘中育苗，然后移栽至田间，紫色植株为正常二倍体，绿色植株为单倍体植株。

1.2.5数据分析

数据采用基于R-nj遗传标记系统的籽粒初筛，然后用不同浓度的秋水仙素对相应参试材料处理不同时间，每个处理2次重复；再将处理后的种子育苗移栽大田，再根据形态学鉴定出单倍体植株；数据采用SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 农大高诱1号对不同种质自交系单倍体诱导率的分析

由表1可见，9个自交系的单倍体平均诱导率为1.86%，诱导率最高的是5.54%(02 H 58)，其次为2.43%(木6)，最低的为0(Y 054)。对不同杂优类群种质自交系分析发现，诱导率高低顺序依次是P群、旅大红骨、苏湾、墨白、地方种、兰卡斯特、塘四平头。可见，农大高诱1号对不同种质自交系的诱导效率存在差异。

表1 农大高诱1号对不同种质自交系的诱导率

2.2 农大高诱1号对不同杂交种质单倍体诱导率的分析

由表2可看出，13个杂交种质的单倍体平均诱导率为2.51%，诱导率最高的是5.85%(毕单18)，其次为4.94%(T 32×R 273)，最低的为0.17%(BND 001)。对不同杂优类群杂交种质诱导率分析发现，同一杂优类群内部杂交的杂交种质诱导率高低顺序依次是苏湾×苏湾、瑞德×瑞德、P群×P群、兰卡斯特×兰卡斯特、塘四平头×塘四平头、墨白×墨白、地方种。不同杂优类群杂交种质的诱导率高低顺序依次是兰卡斯特×P群、兰卡斯特×瑞德、P群×瑞德。

表2 农大高诱1号对不同杂交种质的诱导率

2.3 农大高诱1号对不同杂优类群、不同世代单倍体诱导率的分析

将所有参试材料按照杂优类群进行划分(表3)，统计结果表明，墨白、P群、苏湾、兰卡斯特和塘四平头自交系种质平均诱导率分别为1.50%、5.54%、1.56%、1.22%和0.95%，墨白、P群、苏湾、兰卡斯特和塘四平头杂交种质平均诱导率分别为1.62%、2.73%、4.94%、2.00%和1.66%。可见，自交系种质中，P群的平均诱导率最高；杂交种质中，苏湾的平均诱导率最高。除P群自交系种质诱导率高于杂交种质外，其余种质资源均为杂交种质诱导率高于自交系种质。

表3 农大高诱1号对不同杂优类群、世代单倍体诱导率统计结果

2.4 单倍体籽粒鉴定与植株鉴定

本研究基于R-nj遗传标记系统对玉米籽粒进行单倍体鉴定，结果(表4)表明，二者结果差异较大，错误率极高，错误率最高的为Y 054，达到100%，最低的为Mo 17×B 73，达71.38%，可见利用肉眼对籽粒进行单倍体鉴定结果较不准确，需进一步的田间植株鉴定。

表4 单倍体籽粒鉴定与植株鉴定

2.5 不同种质自交系、杂交种单倍体诱导率的比较

不同种质自交系诱导率比较发现(表5)，墨白、P群、地方种、旅大红骨、苏湾、兰卡斯特和塘四平头间差异均达显著水平(p<0.01)；不同杂交种质诱导率比较发现(表6)，墨白×墨白和塘四平头×塘四平头种质诱导率未达显著水平(p>0.05)，兰卡斯特×瑞德、苏湾×苏湾、兰卡斯特×P群、兰卡斯特×兰卡斯特、P群×P群、P群×瑞德、地方种和瑞德×瑞德间差异均达到显著水平(p<0.01)。

表5 不同种质自交系间的诱导率多重比较

表6 不同杂交种质间的诱导率多重比较

3 讨 论

本研究结果表明，农大高诱1号对9个自交系的单倍体平均诱导率为1.86%，13个杂交种质的单倍体平均诱导率为2.51%，农大高诱1号对不同基因型(自交系和杂交)种质的诱导效率存在差异。自交系的单倍体平均诱导率比中国农业大学选育的农大高诱1号对不同基因型材料单倍体诱导率低(5.34%)[11]，也比农大高诱1号不同种质和世代单倍体诱导率低(3.9%)[14]，这可能与黔西北地区独特的种质资源基因型有关，还有待进一步分析。本研究的杂交种质的单倍体平均诱导率与马骏等[15]的农大高诱1号对玉米不同材料诱导结果(2.25%)相近，马骏等选用的母本为引进的抗大斑病材料与辽宁省农业科学院玉米研究所选育的骨干自交系杂交的F1。

所有参试材料按照杂优类群进行划分，墨白种质、P群种质、苏湾种质、兰卡斯特种质、塘四平头种质自交系的平均诱导率为1.50%、5.54%、1.56%、1.22%、0.95%；墨白杂交种质、P群杂交种质、苏湾杂交种质、兰卡斯特杂交种质、塘四平头杂交种质的平均诱导率为1.62%、2.73%、4.94%、2.00%、1.66%，除P群自交系种质诱导率高于杂交种质外，其余种质资源均是杂交种质诱导率高于自交系种质。本研究中，农大高诱1号对苏湾杂交种质的诱导率最高，墨白杂交种质诱导率最低，且不同杂交种质群之间的差异显著。这和李国良等[14,16]的研究结果不同：农大高诱1号对兰卡斯特群诱导率最高，热导地方种质群诱导率最低，与4大种质类群差异显著。Chase SS[17]认为，诱导效率与被诱导材料的基因型有很大关系，是由于母本基因型所产生的雌配子中有害基因的频率不同造成的，经过多代农艺性状改良的材料作母本比未经改良材料产生单倍体频率高。除P群自交系种质外，本研究的其他结果和Chase SS的观点一致。在育种实践中，按照杂优类群来选择种质非常重要。