外源硝普钠对盐胁迫下牛大力胚根生理指标的影响

邓禄军，李金玲，夏锦慧，范士杰，谢永军，韦忠斌

(1.贵州省农业科学院生物技术研究所，贵阳 550006；2.贵州省药用植物繁育与种植重点(工程)实验室，贵阳 550025)

牛大力(MillettiaspeciosaChamp.)又名血藤、血风藤、倒吊金钟、甜牛大力、甜牛力、美丽崖豆藤，为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤[1-3]，主要分布于福建、湖南、广东、广西、海南、贵州等地[4]。牛大力以干燥块根入药，性平、味甘，归肺、肾经，具有补虚润肺、强筋活络和健脾的功效[5]。牛大力为豆科植物，种子粒大饱满，目前培育优良种苗可通过种子发芽繁殖实现。近年来国内外学者对牛大力萌发特性[6,7]、种质资源[8]、生物学特性[9]、组织培养[10]、药理毒理作用[11]、化学成分、分子生物学[12]、多糖提取工艺[13]等进行了一定的研究。多年来，由于过度采挖，野生牛大力资源濒临枯竭，急需人工种植技术[14,15]。近些年在市场上供不应求，人工种植面积不断扩大[7]，目前产区主要通过种子育苗扩大种植，但由于牛大力种子发芽率相对较低，发芽不整齐，发芽后成苗率低，很大程度上增加了育苗成本，为了提高种子发芽成苗率、探索种子发芽后胚根生理变化和种子育苗应用奠定基础。

土壤盐渍化是全球性的难题，是限制植物生产的主要影响因素之一[16]。添加外源物质是缓解盐胁迫的一种主要措施，并逐渐受到关注，成为研究和讨论的热点[17,18]。为此，开展盐胁迫及外源供体硝普钠对盐胁迫下牛大力种子萌发胚根可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛及酶活性等生理指标的影响，以期为了解外源SNP施用对盐胁迫下牛大力种子萌发胚根的缓解效应，并揭示其缓解机理，为深入研究牛大力幼苗的实际生产提供理论依据，为盐碱土壤上的牛大力栽培提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

牛大力种子来自江苏省宿迁市沭阳县颜集镇，成熟种子。

1.2 实验方法

1.2.1实验设计

牛大力种子洗净消毒，用无菌水清洗备用。盐处理对牛大力胚根的影响试验，设定Na+浓度梯度为0、10、30、50、70、90 mmol·L-1，其中0蒸馏水(ck)，将处理好的种子点播于纸床培养皿中，加入相应的Na+浓度梯度盐溶液置于培养箱中培养，温度设置为23 ℃。选定盐胁迫浓度70 mmol·L-1，进行外源SNP处理对盐胁迫下牛大力胚根的影响试验，将处理好的种子点播于纸床培养皿中，加入70 mmol·L-1Na+盐溶液，再根据表1试剂加入相对应的SNP浓度溶液，置于23 ℃的培养箱中培养。

表1 不同浓度梯度外源SNP处理

1.2.2实验方法

牛大力种子萌发6 d的胚根用生理盐水冰浴研磨提取，4 ℃冷冻离心机4 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，放入4 ℃冰箱，备用。可溶性糖采用蒽酮比色法[19]测定；可溶性蛋白采用考马斯亮兰染色法[19]测定；脯氨酸采用茚三酮比色法[19]测定；丙二醛、POD、SOD均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.2.3数据统计分析

采用Excel软件进行数据统计和作图，SPSS 19.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 外源SNP对盐胁迫下牛大力胚根可溶性糖的影响

由图1可知，可溶性糖含量在盐胁迫浓度为0时达到最高(54.15 mg·g-1)，之后随Na+浓度升高呈降低—升高—降低变化的趋势。其中，Na+浓度由10 mmol·L-1到50 mmol·L-1，可溶性糖含量由37.79 mg·g-1增加至52.61 mg·g-1；Na+浓度为50～70 mmol·L-1时可溶性糖含量急速下降，之后随Na+浓度升高可溶性糖含量略有上升。

图1 盐胁迫下牛大力胚根可溶性糖含量变化

由图2可知，在盐胁迫浓度为70 mmol·L-1时，牛大力胚根可溶性糖含量随外源SNP浓度的升高呈上升—下降的变化趋势。其中，对照处理(SNP ck)的胚根，可溶性糖含量最高，为63.26 mg·g-1；ck处理下，胚根可溶性糖含量为43.58 mg·g-1；外源SNP浓度由20μmol·L-1到40μmol·L-1时，可溶性糖含量由62.15 mg·g-1增加至68.05 mg·g-1。可溶性糖含量在外源SNP浓度为40μmol·L-1时达到最大值；之后随外源SNP浓度上升，可溶性糖含量缓慢下降。低浓度外源SNP不能增加盐胁迫下牛大力胚根的可溶性糖含量；适量的外源SNP能够促进盐胁迫下牛大力胚根的可溶性糖含量增加；盐胁迫下高浓度外源SNP降低牛大力胚根的可溶性糖含量。从可溶性糖指标看，外源SNP 在一定程度上可以有效缓解盐对牛大力种子萌发的胁迫，最佳缓解浓度是40μmol·L-1。

图2 外源SPN对NaCl胁迫下牛大力胚根的可溶性糖含量变化

2.2 外源SNP对盐胁迫下牛大力胚根可溶性蛋白含量的影响

由图3可见，牛大力胚根可溶性蛋白含量随盐胁迫浓度升高呈上升—下降的变化趋势。其中，Na+浓度由0到50 mmol·L-1时，可溶性蛋白含量缓慢上升，由38.58 mg·g-1增加至48.77 mg·g-1，牛大力的抗逆性得到激活；Na+浓度由50 mmol·L-1到90 mmol·L-1时，可溶性蛋白含量迅速下降，由48.77 mg·g-1减少至30.20 mg·g-1，牛大力抗逆性出现衰减；在盐胁迫浓度为50 mmol·L-1时，可溶性蛋白含量达到最高。

图3 盐胁迫对牛大力胚根可溶性蛋白含量变化

牛大力胚根在盐胁迫下，可溶性蛋白含量随外源SNP浓度的升高呈先下降后上升变化趋势，并且逐步稳定，见图4。其中，SNP ck处理的胚根，可溶性蛋白含量达到最大，为36.68 mg·g-1；外源SNP浓度为0的胚根，可溶性蛋白含量为27.35 mg·g-1；外源SNP浓度为20μmol·L-1时的可溶性蛋白含量达最低值，为24.99 mg·g-1。外源SNP浓度由40 mmol·L-1到120μmol·L-1，可溶性蛋白含量由32.90 mg·g-1至33.50 mg·g-1，变化不大。

图4 外源SNP对牛大力胚根可溶性蛋白含量变化

2.3 外源SNP对盐胁迫下牛大力胚根脯氨酸含量的影响

由图5可知，当Na+浓度为0时，牛大力胚根脯氨酸含量最高，达77.12μg·g-1，之后随盐胁迫浓度升高呈先升高后降低的变化趋势；在Na+浓度为50 mmol·L-1时，胚根脯氨酸出现二次峰值，为49.37μg·g-1。表明适量的盐胁迫促进了脯氨酸的积累。

图5 盐胁迫对牛大力胚根脯氨酸含量变化

由图6可知，牛大力胚根在盐胁迫下，脯氨酸含量随外源SNP浓度的升高呈先上升后下降的变化趋势。其中，ck处理的胚根，脯氨酸含量达到76.07μg·g-1；外源SNP浓度为0的胚根，脯氨酸含量最低，为23.81μg·g-1；外源SNP浓度由0μmol·L-1到40μmol·L-1时，脯氨酸含量急速上升，由23.81μg·g-1增加至79.30μg·g-1，且在外源SNP浓度为40μmol·L-1时脯氨酸含量达到最高；脯氨酸的积累有效地对抗盐逆境胁迫，表明硝普钠的加入缓解了盐胁迫。

图6 外源SNP对牛大力胚根脯氨酸含量变化

2.4 外源SNP对盐胁迫下牛大力胚根丙二醛含量的影响

由图7可知，牛大力胚根的丙二醛含量随盐胁迫浓度上升呈上升的变化趋势。其中，Na+浓度由0到10 mmol·L-1时，丙二醛含量缓慢下降，由41.06μmol·g-1下降至35.37μmol·g-1；Na+浓度由10 mmol·L-1到90 mmol·L-1时，丙二醛含量逐渐升高。可见，牛大力胚根的丙二醛含量与逆境环境的伤害程度有密切相关性，表明盐胁迫诱导丙二醛含量的积累，促进膜脂过氧化对牛大力胚根的伤害。

图7 盐胁迫对牛大力胚根丙二醛含量变化

由图8可知，外源SNP对盐胁迫下牛大力胚根的丙二醛含量的影响呈先下降后缓慢上升的变化趋势。与ck相比，NaCl处理下牛大力胚根中的丙二醛含量提高了89.57%；外源SNP浓度由0到40 mmol·L-1时，NaCl胁迫下牛大力胚根丙二醛含量由46.73μmol·g-1下降至35.23μmol·g-1；随着外源SNP浓度增高丙二醛含量缓慢升高，当外源SNP浓度为120μmol·L-1时，丙二醛含量未超过NaCl胁迫下SNP浓度为0处理，表明外源SNP的加入缓解了盐胁迫对牛大力胚根的影响。

图8 外源SNP对牛大力胚根丙二醛含量变化

2.5 外源SNP对盐胁迫下牛大力胚根酶活性的影响

由图9可以看出，牛大力胚根的POD活力随盐胁迫浓度上升呈先上升后下降的变化趋势。其中，Na+浓度由0到50 mmol·L-1时，POD活力缓慢上升；Na+浓度由50～90 mmol·L-1时，POD活力迅速下降。在Na+浓度为50 mmol·L-1时，POD活力达到最大值。

图9 盐胁迫对牛大力胚根的POD活力变化

由图10可知，牛大力胚根的POD活力在盐胁迫浓度下，随外源SNP浓度上升总体呈先上升后下降的变化趋势。其中，ck是蒸馏水处理(对照)，POD活性较高；在盐胁迫浓度下，外源SNP浓度从0到80μmol·L-1，POD活力逐渐升高，当SNP浓度80μmol·L-1时，POD活力达88.20 U·g-1；而后随着SNP浓度升高，POD活力下降。在盐胁迫下，添加SNP后牛大力胚根POD活性均高于未添加处理，表明牛大力种子在盐胁迫逆境环境中，添加外源SNP缓解了盐胁迫对其胚根的影响。

图10 外源SNP对牛大力胚根的POD活力变化

SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，该酶能清除超氧阴离子自由基，减少亚硝酸盐的形成，保护细胞免受损伤。盐胁迫对牛大力胚根的SOD活力的影响见图11，牛大力胚根的SOD活力随盐胁迫浓度上升呈先上升后下降的变化趋势。SOD活力在Na+浓度由0到10 mmol·L-1时，先降低而后逐渐升高，当Na+浓度50 mmol·L-1时达到最高，为825.20 U·g-1；随着Na+浓度升高，SOD活力呈下降趋势。

图11 盐胁迫对牛大力胚根的SOD活力变化

外源SNP对牛大力胚根的SOD活力的影响见图12，ck处理牛大力胚根SOD活力最大；牛大力胚根的SOD活力在盐胁迫浓度下，外源SNP浓度从0到80μmol·L-1，SOD活力逐渐升高；而后随着SNP浓度升高，SOD活力下降。表明一定浓度的外源SNP可缓解牛大力胚根在盐胁迫下的伤害。

图12 外源SNP对牛大力胚根的SOD活力变化

3 结论与讨论

3.1 讨 论

种子萌发即胚根的产生是蛋白质、淀粉和脂肪等贮藏物质的转化过程，伴随很多酶参与调控的生化反应。已有研究结果证实，SOD是清除超氧阴离子自由基的重要酶，POD是清除H2O2的关键酶[20,21]，反应了植物体内代谢的变化，对植物的生长和发育有着重要的影响作用。在盐胁迫下，植物因盐伤害而使细胞膜受到损伤，产生大量的丙二醛，膜受伤害又产生大量超氧阴离子自由基，此时植物的保护酶系统被激活。POD和SOD是植物体内酶促防御系统的重要保护酶，它们发挥协同作用，消除活性氧，保护植物膜系统。本实验中，在盐胁迫下，丙二醛含量逐渐上升，可溶性糖、脯氨酸含量变小，可溶性蛋白呈先升高后降低趋势，这与李志萍等[22]研究的NaCl和Na2CO3对栓皮栎种子萌发的结果相似。

SNP是一种常用的外源NO供体，NO作为一种信号分子和活性氧清除剂，能调节植物对生物和非生物胁迫的适应及反应[17]。本研究发现，适量浓度的SNP缓解盐胁迫对牛大力种子胚根的伤害，这与郭栋等[17]研究的结果一致。在盐碱地进行牛大力种子萌发与育苗，可适当添加低浓度SNP，以缓解盐胁迫对牛大力种子萌发及幼苗生长的影响。

牛大力在广东、福建、广西、海南等地进行人工种植，部分种植区域临海较近，属于盐碱地，而牛大力种苗均采用种子育苗，开展盐胁迫及外源SNP缓解盐胁迫对牛大力胚根生理指标的影响研究，在牛大力种子发芽关键时期，揭示其胚根生理代谢变化规律，为生产上获得优质牛大力种苗提供理论基础，对牛大力产业发展具有重要意义。

3.2 结 论

中性单盐(NaCl)胁迫对牛大力胚根生理指标有一定影响。低浓度盐胁迫促进牛大力胚根可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加，而随着盐浓度增加，各指标含量均出现不同程度的下降；牛大力胚根丙二醛含量随着盐浓度增大呈现上升变化；牛大力胚根SOD和POD活力随着盐胁迫浓度升高呈先升高再下降的变化趋势。

适量添加外源SNP能缓解盐胁迫对牛大力胚根的伤害。添加低浓度外源SNP能增加可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量，随着外源SNP浓度增加，各指标出现不同程度的下降；添加低浓度外源SNP牛大力胚根丙二醛含量下降，随着SNP浓度增大丙二醛呈上升变化；牛大力胚根SOD和POD活力随着外源SNP浓度升高呈先升高再下降的变化趋势。