快速溶剂萃取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法快速测定淀粉类农作物中4种形态硒

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(1.浙江省生态环境监测中心,杭州 310012; 2.浙江环境监测工程有限公司,杭州 310012;3.赛默飞世尔科技(中国)有限公司,上海 201206)

硒具有抗癌、保护肝脏、消除自由基和提高免疫等生物学功能[1]。自然界中硒主要以无机硒和有机硒两种形态存在。无机硒主要是硒酸根[Se(Ⅵ)]和亚硒酸根[Se(Ⅳ)],有机硒主要指硒代氨基酸和含硒蛋白质。硒代氨基酸在生物体内最主要的形态是硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基-硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(Se Met)[2]。不同形态的硒化合物营养学和毒理学性质不同。无机硒营养价值不高,且过量有毒。对人体有益的其实是有机硒(主要是Se Met)[3]。因此检测农产品中硒含量时不仅要测元素总量,还要测其形态。但形态硒尤其是有机硒很不稳定性,在提取和保存过程中易发生变化,这是形态硒检测的难点。

稻米、玉米、番薯等农作物是中国粮食作物的主要品种,其含有较高的淀粉比例。这类农作物中的形态硒主要以非水溶性为主,采用普通的酸、缓冲盐无法完全提取。为准确测定其形态硒含量,在前处理时一般需加入蛋白酶进行酶解提取。目前常用的提取方法有水浴振荡或超声波法。前者萃取效果好、但耗时很长,需5～36 h不等[4-5];后者提取速率快,但工作时产生的热量会使对温度敏感的蛋白酶失去生物活性,进而影响酶解效果。还有报道超声波会破坏硒化合物的结构[2,5]。快速溶剂萃取(ASE)是近十年来新兴的快速提取技术[6]。本工作采用快速溶剂萃取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(ASE-HPLC-ICP-MS)测定淀粉类农作物中常见的5种形态硒[Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、MeSeCys、Se Met]的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

赛默飞世尔iCAP RQ型电感耦合等离子体质谱仪;戴安ICS-1500型高效液相色谱;戴安ASE 350型加速溶剂萃取仪。

标准物质:Se(Ⅵ)(GBW 10033)、Se(Ⅳ)(GBW 10032)、MeSeCys(GBW 10088)、SeCys2(GBW 10087)。

SeMet纯度为98%;富硒小麦粉国际标准物质(ERM-BC210a);七氟丁酸和甲醇均为色谱纯;磷酸二氢钾为优级纯;蛋白酶XIV(酶活性不小于3.5 U·mg-1);蛋白酶K(30 U·mg-1);试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)快速溶剂萃取条件 工作温度40 ℃;压力10 MPa;加热时间5 min,静态萃取时间5 min;循环次数3次;氮气吹扫时间100 s;浸提试剂为纯水,冲洗体积100%。

2)色谱条件 Hypersil Gold C8色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为20 mmol·L-1磷酸二氢钾-0.1%(体积分数,下同)七氟丁酸-5%(体积分数,下同)甲醇混合溶液,等度分离;流量为1.2 mL·min-1。

3)ICP-MS条件 射频功率为1 550 W;雾化气流量为0.90 L·min-1,冷却气流量为14.0 L·min-1,辅助气流量为0.8 L·min-1,碰撞气流量为4.5 mL·min-1;保留时间为0.1 ms;检测同位素为78Se。

1.3 试验方法

将去皮的土豆切成小块,玉米用水冲洗3次后,放入冷冻机中干燥,再用粉碎仪磨成粉状;稻米和莲子直接磨成粉状保存。分别称取0.300 0 g样品和0.03 g蛋白酶XIV于样品池中,混匀,用水作提取剂。提取后,用水定容至100.0 mL,摇匀,立即用超滤离心管过滤后供HPLC-ICP-MS测定。提取液于4 ℃保存,24 h内完成上机分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

不同代表性样品的色谱图见图1。

2.2 酶解试剂及其加入量的选择

蛋白酶XIV[7]和蛋白酶K[8-9]是常用的酶解试剂。以0.300 0 g含有SeMet的小麦粉标准物质(ERM-BC210a)为试验对象,试验考察了这2种酶及其不同加入量(0～0.06 g)对SeMet提取效果的影响,结果见图2。

由图2可知:蛋白酶XIV的酶解效果明显优于蛋白酶K。蛋白酶XIV的加入量增加到0.03 g时SeMet的萃取浓度达到了峰值。因此,试验选择蛋白酶XIV作为样品的酶解试剂,其加入量为0.03 g。

2.3 ASE工作参数的选择

图1 不同样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of the different samples

图2 蛋白酶加入量试验Fig.2 Test of the added amount for protease

蛋白酶XIV的最佳酶解温度约为37 ℃。由于ASE仪器最低加热温度为40 ℃,试验考察了室温、40 ℃和43℃等3个温度下蛋白酶XIV对含Se Met小麦粉的酶解效果的影响。结果表明:当酶解温度为40 ℃时,提取效率最高,提取效率达到了90%以上;当酶解温度大于40℃时,蛋白酶逐渐失活,提取效率降低。

试验同时考察了5,10,15 min不同的静态萃取时间对萃取效率的影响。结果表明:3个不同静态萃取时间对萃取效率作用没有显著区别,则试验选择最小值5 min。为了确保充分的提取,采用循环提取3次,每个样品完成提取总计需要时间为25 min,提取速率明显优于水浴振荡法。

2.4 提取过程形态硒的稳定性试验

50μg·L-1硒标准溶液放置60 d,回收率仍可达到90%以上。为了检查ASE提取过程是否破坏形态硒的结构,对Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、SeCys2和Se Met等5种形态硒标准溶液及小麦粉标准物质提取液的稳定性进行了试验,结果见表1。

表1 形态硒稳定性试验结果Tab.1 Results of stability test of the selenium species

由表1可知:20μg·L-1硒混合标准溶液提取液放置1 d后检测,除SeCys2的回收率降为11.2%,其余4种形态硒回收率良好。SeCys2结构很不稳定性,其Se-Se键极易断裂分解[2]。酶解试剂的生物活性可能加速了其Se-Se键的断裂,导致了SeCys2的快速分解。而加标小麦粉提取液未经超滤离心放置1 d后检测,除Se(Ⅵ)外,其余4种形态硒的回收率均很低,尤其是Se(Ⅳ)和Se Met的回收率均为零。文献[8]对巴西坚果的蛋白酶K提取液进行Se(Ⅳ)加标试验时也发现其回收率为零,推断是酶提取液中的生物大分子将Se(Ⅳ)还原为硒离子(Se2-)或硒元素。而SeCys2、MeSeCys和Se Met的回收率低可能是残留的蛋白酶XIV与其发生了进一步的反应。提取完成后立即用超滤离心管过滤去除生物基体和蛋白酶后检测,除SeCys2的回收率为10.2%外,其余4种形态硒的回收率为8.0%～109%,结果令人满意。经过滤后的提取液放置3 d后复测,其回收率为1.8%～77.1%。因此,样品提取液应于4 ℃低温保存,24 h内尽快完成上机分析。

2.5 色谱分离条件的选择

反相离子对色谱结合电感耦合等离子体质谱法常被用于形态硒的分离检测。全氟羧酸[10]、烷基磺酸钠、氢氧化四甲基铵等反相离子对试剂[11]可作为流动相成分。目前HPLC-ICP-MS测定形态硒的报道中最常采用的液相柱为Hamilton PRP阴离子交换柱[7],采用Waters Symmetry Shield RP18[12]和C18柱[3]等,C8柱的报道极为少见。试验以Hypersil Gold C8柱为分离柱,以0.1%七氟丁酸溶液为反相离子对试剂,通过加入不同浓度的盐来调节流动相的酸度和离子强度以优化分离效果。结果表明:加入10～30 mmol·L-1氯化铵溶液时,流动相为中性,C8柱无法分离Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ);加入10 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液时,流动相呈酸性,两种无机硒得到了有效分离。这可能是两者在酸性条件pKa值不同导致[13]。但该条件下MeSeCys、Se Met分离效果不佳。磷酸二氢钾浓度为20 mmol·L-1时5种形态硒能够达到良好的分离。当磷酸二氢钾浓度为25 mmol·L-1时色谱分离时间进一步缩短。考虑到流动相要进入ICP-MS进行定量检测,高浓度盐分易堆积在ICP锥孔上引起检测信号漂移,因此,试验选择磷酸二氢钾的浓度为20 mmol·L-1。同时流动相还加入了体积分数为5%甲醇溶液以提高流动相的极性,可在6 min内在C8柱上实现5种形态硒的有效分离。

2.6 标准曲线和检出限

按照试验方法对5种形态硒混合标准溶液系列进行测定,结果表明:5种形态硒的质量浓度在一定范围内与其色谱峰面积呈线性关系,其线性参数见表2。

按照试验方法对低浓度植物样品加入0.5μg·L-1的5种形态硒混合标准溶液进行试验,平行测定7次,按照HJ 168-2010《环境监测分析方法标准制修订技术导则》中的方法,以3.14倍标准偏差(s)计算检出限。当称样量为0.3 g,萃取液的定容体积为100 mL时,方法的检出限(3.14s)结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法在莲子样品中同时加入低和高2个浓度水平的5种形态硒混合标准溶液并进行测定,6次平行测定的相对标准偏差(RSD)结果见表3。

由表3可知:Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、Se Met回收率为81.6%～110%,SeCys2不稳定性,在酶解过程极易分解,回收率极低。

2.8 样品分析

按照试验方法对ERM-BC210a国际标准物质富硒小麦粉进行测定,经含水率(95%)折算后,测得Se Met的质量分数为9.72 mg·kg-1,与认定值为(10.8±1.0)mg·kg-1相符。试验采集、检测了浙江省各个地市约20个土豆、玉米、稻米、莲子等淀粉类农作物,结果以Se(Ⅳ)为主,仅2个样品中检出Se(Ⅵ),其质量分数均为0.30 mg·kg-1,均未检出有机硒。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

本工作以ASE为前处理方法、C8柱为分离柱,建立了一种淀粉类农作物中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys、Se Met的HPLC-ICP-MS快速分析方法。单个样品的前处理时间短,优于现行国家标准GB 1903.28-2018中的36 h。本方法操作简便、自动化程度高、适合在农业部门推广使用。SeCys2在C8柱上也可以有效分离,但由于在酶解提取过程易裂解而无法准确测定,这将是课题组后续工作继续研究的方向。