QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定葡萄等浆果中7种酰胺类杀菌剂残留量

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浆果类水果品种繁多[1-3],如葡萄、草莓、番茄、猕猴桃和无花果等,深受广大人民群众的喜爱,是人类日常食用的水果大类;我国是浆果类水果种植大国,如我国葡萄种植面积现居世界第二位,种植品种约100种之多,浆果类水果在种植过程中,病虫害是影响该产业的最主要的因素。据统计,危害葡萄的病虫害有40多种[4-7],霜霉病、灰霉病等是影响其产量最主要的因素;酰胺类杀菌剂[8-10]是指化学结构中含有酰胺结构的一类化学杀菌剂,对防治浆果类水果中的霜霉病、灰霉病等有较好的效果。目前,酰胺类杀菌剂是近年来新品种开发最多的一类杀菌剂,市场份额逐年增加;酰胺类杀菌剂具有广谱、低毒、易降解等特点,但误食用到该类杀菌剂仍会对人类的身体造成亚急性中毒,轻者头晕和心悸等,重者呕吐、痉挛和四肢无力等,因此加强对浆果类水果中酰胺类杀菌剂残留量的监测,具有十分重要的意义。

目前,浆果类水果中农药残留检测前处理的主要方法有固相萃取法[11]、凝胶净化色谱-浓缩法[12-13]和QuEChERS提取法[14-17]。国家标准GB 23200.8-2016《水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定》中气相色谱-质谱法是较为权威的测定方法,其中前处理方法为氨基柱(NH2)固相萃取法。固相萃取法和凝胶净化色谱-浓缩法,仪器自动化程度高,但处理过程冗长,处理过程中易造成待测物的损失,检测准确度较低,且试剂的使用量较大,易对环境造成污染;QuECh ERS提取法是近年来发展起来的一种快速样品前处理技术,处理过程简单,效率高且检测准确度高,溶剂使用量低,环境友好度高。本工作采用QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定葡萄等浆果中7种酰胺类杀菌剂残留量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

2010 PLUS型气相色谱仪;TQ-8040型三重四极杆质谱仪;AB-135型电子天平;N-EVAP型氮吹仪;H205R型高速冷冻离心机。

环氧七氯(内标液)、甲霜灵、呋霜灵、苯霜灵、环酰菌胺、苯酰菌胺、环氟菌胺、噻呋酰胺标准溶液:100 mg·L-1。

内标溶液:移取100 mg·L-1环氧七氯标准溶液1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,用正己烷稀释、溶解,配制成质量浓度为10 mg·L-1的溶液,备用。

标准储备溶液:分别移取质量浓度均为100 mg·L-1的甲霜灵、呋霜灵、苯霜灵、环酰菌胺、苯酰菌胺、环氟菌胺、噻呋酰胺标准溶液各2.00 mL,置于20 mL容量瓶中,用正己烷溶解、定容,配制成质量浓度为10 mg·L-1的标准储备溶液。使用时用正己烷稀释至所需质量浓度。

乙腈、正己烷均为色谱纯;N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基硅烷(C18);无水硫酸镁、乙酸均为分析纯。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),柱温320 ℃,进样口温度为250 ℃;不分流进样;载气为氦气,纯度大于99.999%,载气流量为1.8 mL·min-1;进样量为1.0μL。柱升温程序:初始温度60℃,保持2 min;以20 ℃·min-1速率升温至180 ℃,保持3 min;再以15 ℃·min-1速率升温至280 ℃,保持10 min。

2)质谱条件 电子轰击(EI)离子源;多反应监测(MRM)模式;轰击能量为70 e V;离子源温度为260 ℃;接口温度为250 ℃;碰撞气为氩气(纯度大于99.999%);溶剂延迟时间为3.0 min;其余质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

将新鲜采摘的葡萄样品用粉碎机粉碎、充分搅匀,制成匀浆。称取已均质的葡萄样品5.0 g,放入25 mL离心管中,加入1%(体积分数,下同)乙酸-乙腈溶液20 mL,无水硫酸镁5 g,振摇10 min,以6 000 r·min-1转速离心5 min。将离心后的有机层溶液转移至预先加入无水硫酸镁1.0 g、PSA 500 mg和C18500 mg,GCB 500 mg的25 mL离心管中,剧烈振摇3 min,使样品得以充分净化。再以6 000 r·min-1的转速离心5 min。取上清液5.0 mL至刻度试管中,于60 ℃水浴式氮吹仪中用氮气吹至近干,残渣用正己烷定容至1.0 mL。经0.2μm有机滤膜过滤后转移至小进样瓶中,加入10 mg·L-1的环氧七氯溶液20μL,混匀,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

7种杀菌剂混合标准溶液的标准谱图见图1。

图1 7种杀菌剂混合标准溶液的标准谱图Fig.1 Standard spectrum of mixed standard solution of seven fungicides

2.2 前处理方法的选择

试验分别考察了氨基固相萃取柱和Qu ECh ERS前处理方式对样品净化和回收效果的影响,在空白葡萄样品中加入质量浓度为0.1 mg·L-1的7种酰胺类杀菌剂混合标准溶液,按照仪器工作条件进行测定,结果见表2。

由表2可知:氨基固相萃取柱净化效果较好,但是样品的回收率最低;QuEChERS前处理方式所得的测定结果中7种酰胺类杀菌剂的回收率均高于固相萃取柱萃取结果。原因可能是氨基固相萃取柱对酰胺类杀菌剂的吸附性较强,Qu ECh ERS所用的净化剂PSB、GCB和C18为非极性,对酰胺类杀菌剂无吸附作用。考虑到Qu ECh ERS处理过程中所用溶剂较少、且前处理快速,试验选择QuEChERS作为前处理方式。

表2 QuEChERS方法与国家标准前处理方法提取结果比较Tab.2 Comparison of extraction results of pre-treatment method of QuEChERSand national standard%

2.3 萃取溶剂的选择

试验考察了乙酸乙酯、丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液等4种不同萃取溶剂的萃取效果。在加入最终质量浓度为0.1 mg·L-1的混合标准溶液时,其他条件保持不变,按照试验条件测定了乙酸乙酯、丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液等萃取溶剂所得到的回收率,测定结果见表3。

表3 不同溶剂萃取效果的比较Tab.3 Comparison of extraction efficiency of different solvents%

由表3可知:乙酸乙酯萃取时,葡萄等浆果中的糖分、蜡质也被共提出来,质谱离子肼及气相色谱进样口容易污染导致灵敏度降低;丙酮作为萃取溶剂时,由于丙酮的极性较弱,对极性较强的农药如环酰菌胺、环氟菌胺等萃取效果不理想,回收率偏低。乙腈是萃取中应用最多的一种溶剂,对大多数农药溶解性好,共提物少,可以有效降低基线噪声,提高检测灵敏度。考虑到酸碱敏感性农药的稳定性,试验选择了1%乙酸-乙腈溶液为萃取溶剂。

2.4 基质效应的影响

基质效应是待测样品中除目标物以外的其他成分对测定结果的影响。一般来说,不同的样品基质对测定值的影响亦不同。研究表明:在气相色谱-质谱法中,大多数样品对待测物存在基质增强效应。当前农残处理常用的消除基质效应的方法为基质匹配标准法,该方法以模拟样品环境的方式(如称取待测样品,在萃取、净化、浓缩后的提取物中,用标准曲线溶液系列配制不同浓度点的基质匹配溶液)来补偿样品中农药的吸附或降解。试验采用加入内标物环氧七氯的方式来消除色谱系统进样带来的误差及前处理导致的损失。基质标准液内标法为本方法定量检测的依据。本方法仍以加入质量浓度为0.1 mg·L-1的混合标准溶液来考察标准溶液与内标基质匹配标准溶液校正所得到的回收率,结果见表4。

表4 纯标准溶液与基质匹配标准溶液比较Tab.4 Comparisons of pure standard solution and matrix matching standard solution%

由表4可知:加入内标物环氧七氯后,7种杀菌剂残留量的回收率为89.2%～93.6%,相比较未加内标物回收率为82.6%～89.5%,说明采用环氧七氯作为内标物的方法具有更好的准确度。

2.5 质谱条件的优化

采用Q3SCAN全扫描模式对10 mg·L-1的混合标准溶液进行全扫描,得到7种酰胺类杀菌剂相对应的前体离子及保留时间;运行不同碰撞能量产物离子扫描方法,自动比较数据文件,选择合适的产物离子和合适的碰撞能量,然后在该电压下对产物离子进行扫描,得到各自对应的碎片离子;选择响应较高的离子对作为定量离子对,另选择两组离子对作为定性离子对。保留时间、特征离子对保证定性结果的准确性;排除了假阳性样品。使用wizard功能重新优化参比离子的比率,各农药残留的灵敏度均达到最佳状态,检测结果更加准确、可靠,最终生成MRM检测方法。

2.6 标准曲线与检出限

按试验方法对0.04,0.1,0.4,1.0,2.0,4.0 mg·L-1的7种酰胺类杀菌剂混合标准溶液系列进行测定,并绘制标准曲线。结果表明:7种酰胺类杀菌剂的线性范围均为0.04～4.0 mg·L-1,其线性回归方程、相关系数见表5。

以空白葡萄样品的低浓度水平(0.02 mg·kg-1)加标回收的响应为基础,以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),结果见表5。

表5 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.5 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度与回收试验

按照试验方法对空白葡萄样品进行加标回收试验,加标量为0.05,0.1,1.0 mg·L-1,每个加标样品平行进样6次,考察6次测定结果的相对标准偏差(RSD),结果见表6。

由表6可知:3个不同水平的加标回收率为86.2%～100%,RSD为1.6%～4.1%,符合方法中精密度要求。

2.8 样品分析

按照试验方法对葡萄、蓝莓、猕猴桃等3种浆果类水果中7种酰胺类杀菌剂进行测定。结果表明:葡萄、蓝莓与猕猴桃中分别检出甲霜灵为0.011 mg·kg-1、环酰菌胺为0.012 mg·kg-1、环酰菌胺为0.008 mg·kg-1。

本工作采用QuEChERS前处理方法结合气相色谱-串联质谱法建立了葡萄等浆果中酰胺类杀菌剂残留量的测定方法。对前处理方法、萃取溶剂及质谱参数等进行了讨论;考察了方法的线性、检出限及精密度。对葡萄、蓝莓和猕猴桃等浆果类样品进行了测定。该方法缩短了前处理时间,减少了萃取溶剂的使用量,运用三重四极杆质谱分析,避免了假阳性样品的存在。

表6 精密度与回收试验结果(n＝6)Tab.6 Results of tests for precision and recovery(n＝6)