轿子山3种杜鹃根际微生物种群结构研究

殷根深，苏 源 ，董明华，赵昌佑

(1.昆明学院//云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室，云南 昆明 650214; 2.云南轿子山国家级自然保护区管护局，云南 禄劝 651515)

土壤是植物进行生理活动的重要场所，土壤中生活有丰富的微生物，附着于植物根系附近的微生物称根际微生物，其活跃程度是土壤质量变化的重要影响因素之一[1]。根际微生物之间相互影响，形成一个小的生态系统，在这个生态系统内，根际微生物的种群结构变化会对不同植物的生长造成重要影响[2-3]，也就是说，土壤中不同的微生物种群结构适合不同的植物生长。

一般认为，根际微生物种群结构变化与植物物种有关，这是因为植物通过根系的生理活动不断地向土壤中排出根系分泌物，这将影响微生物的生存状态，从而导致微生物群落结构的改变，如Peiffer等通过对玉米根际微生物研究表明，不同物种对其根际微生物群落组成有明显影响[4]；此外，生境也会影响微生物群落结构，因为不同生境中土壤类型和有机质成分的不同，必然会导致不同生境的微生物的种类差异[5]，如不同的稻田基质中，水稻根际微生物群落结构的组成明显不同[6]。但是，目前关于检验物种和生境对某一植物类群的根际微生物群落结构的影响鲜有报道。

云南轿子山位于滇东高原北部，其地理坐标为26°00′25″～26°11′53″N、102°48′21″～102°58′43″E。在相对不大的范围内发育了滇东高原最为完整以及复杂的土壤、自然带的垂直带谱。生境的复杂性带来了极大的植物多样性[7]，据统计，仅杜鹃属(Rhododendron)植物就多达31种[8]，占云南省杜鹃属种类的13.66%[9]，占全国杜鹃属种类的5.72%[10]。在轿子山，杜鹃属植物可以单独形成纯林，也可以几种共生一处。如在海拔 3 600～3 950 m范围内常可见锈红毛杜鹃(R.bureaviiFranch.)、乳黄杜鹃(R.lacteumFranch.)、亮鳞杜鹃(R.heliolepisFranch.) 3种共生(可用来检验相同的生境是否具有相同的微生物群落结构，或是依据物种的不同具有不同的微生物群落结构)，也可以单独形成纯林(可用来验证同一个种在不同的生境中是否具有相近的微生物群落结构)，因此这是一个极好的研究材料。

在以往的研究中，主要通过微生物的分离、培养和鉴定来研究微生物多样性，并不能准确而完整地估计微生物的群落结构[11]。近年来，随着测序技术的进步，基于微生物16S rRNA基因的高通量测序，因其能高通量、高精确地处理大批数据，被广泛应用于微生物生态学领域[12-14]。

本研究以轿子山分布于同一生境以及不同生境的锈红毛杜鹃、乳黄杜鹃、亮鳞杜鹃的6个根际土壤样本为材料，对根际土壤总DNA的16S rRNA基因V3-V4区域进行高通量二代测序，并进行生物信息学分析，来讨论物种和生境对根际微生物种群分布格局的影响。

1 材料与方法

1.1 试验样本的采集

土壤样本于2017年9月采自云南轿子山国家级自然保护区。采样策略为，在海拔 3 790 m处选择有3种杜鹃属植物同生一处的小生境，采集3株不同种杜鹃的根际土壤，两两之间距离不超过70 cm；此外，在这3种杜鹃属植物单独形成的纯林中也分别采集其根际土壤。具体采样信息如表1所示。

表1 采样信息

土壤样本的取样方法：去掉植株基部的浮土，挖取植株后，小心地去掉多余土壤，露出细根，收集细根上的土壤，即为根际土壤。将土壤样本装入一次性自封袋，干冰保存，带回实验室。样本置于-20℃低温冰箱中保存，用于土壤总DNA的提取。

1.2 二代测序

土壤样本送至成都罗宁生物科技公司进行二代测序。主要流程为：(1)提取根际土壤总DNA，并检测DNA质量；(2)对土壤样本总DNA的16S rDNA V4 区域进行PCR扩增，PCR产物回收后，检测质量；(3)构建文库，并检测其质量；(4)合格的文库采用Illumina 公司的HiSeq测序平台的PE250测序方法进行高通量测序。

1.3 生物信息学分析及统计分析

生物信息学分析的主要流程为：(1)使用FLASH4软件对得到的PE reads进行拼接；(2)完成低质量碱基、接头污染序列去除操作后将数据过滤，得到高质量序列；(3)使用UPARSE算法在97%相似性水平上进行OTU(Operational Taxonomic Units)聚类，并挑出OTU的代表性序列；(4)使用Uchime 9 去除嵌合体；(5)使用Silva数据库(http://www.arb-silva.de/)[15]进行物种分类信息划分；(6)使用QIIME、Mothur和R软件对样本进行群落组成分析、Alpha—多样性分析和Beta—多样性分析，并利用R软件作图。

2 结果与分析

2.1 测序质量

过滤后，用于构建OTUs的有效序列数为 218 521 条(其中，DL：77 677 条；CH：76 319 条；DH：27 459 条；CB：14 008 条；DB：13 428 条；CL：9 630 条)，重抽样后，每个样本有 9 268 条序列，共 55 608 条最终序列。在97%相似性水平上共检测到 3 209 个OTUs。利用稀释曲线来判断测序深度，当曲线趋于平缓时，可认为测序深度已经达到基本覆盖到样本中所有物种的要求(图1)。

由图1可知，各样本的稀释曲线已趋于平缓。

2.2 群落组成分析

在97%相似性水平上，基于比对数据库为Silva(http://www.arb-silva.de/)[15]，使用QIIME软件对OTUs代表序列进行物种注释，从而得到每个OTU对应的物种信息。

2.2.1门水平的物种丰度分析

物种注释完成后，对每个样本最大丰度排名前10的门(phylum)进行整理，生成门水平上的丰度图(图2)。

分析结果显示，在这6个样本中，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、软膜菌门(Tenericutes)、WD272为排名前10的菌门。相对丰度大于10%的菌门为优势菌门，除DB外，CL、DL、DH、CH、CB的优势菌门均为变形菌门和厚壁菌门，DB的优势菌门少了变形菌门，而多了拟杆菌门，说明在海拔 3 760 m处的锈红毛杜鹃纯林的根际微生物群落结构相对较特殊。

图1 土壤样本中菌群稀释曲线Fig.1 Dilution curve of flora in soil samples

图2 土壤样本在门水平上的丰度Fig.2 Abundance of phylum in soil samples

2.2.2科水平的物种丰度热图分析

根据所有样本在科水平上的物种注释及丰度信息，绘制科水平的物种丰度热图(图3)。

图3 土壤样本在科水平上的丰度Fig.3 Abundance of family in soil samples

从科的热图上(图3)可以看到，样本DB与其它5个样本存在较明显差异。具体表现为样本DB中Burkholderiaceae的丰度要低很多，而在Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidales S24-7、Prevotellaceae、Lactobacillaceae、Bacteroidales BS11、Rikenellaceae、Bacteroidaceae、Christensenellaceae等科中均有相对较高的丰度，DB样本在科水平上的特殊性和门水平上保持一致。

2.2.3属水平的物种丰度热图分析

3 760 m处的锈红毛杜鹃土壤样本(DB)进一步显示出了与其它5个类群在属水平上的丰度差异(图4)。

从图4可以看出，DB中的变形菌门(Proteobacteria)的Burkholderia丰度极低，这与其它6个样本中极高的丰度存在显著差异。但是在DB中， Sphingomonas，Firmicutes门中的NK4A136、UCG-014、UCG-005以及Lactobacillus， Prevotella，Peptoclostridium，Rikenellaceae科的RC9，Bacteroide，Ruminiclostridium，Ruminococcaceae科的NK4A214，Eubacterium以及Christensenellaceae 科中的R-7具有比其它5个样本均明显较高的丰度。

图4 土壤样本在属水平上的丰度Fig.4 Abundance of genus in soil samples

2.3 根际土壤微生物的Alpha—多样性指数

在微生物生态学中，常利用Alpha—多样性分析来判断微生物群落的丰度和匀度。在本研究中，用观测物种数以及Chao1指数来估计物种的丰度，用香农多样性指数来评价物种的匀度。

利用R软件对6个样本的OTUs 进行分析，得到其根际微生物的Alpha—多样性(表2)。

表2 杜鹃根际微生物多样性指数

表2中6个样本的观测物种数从大到小的排列为：DB>CL>CB>DL>CH>DH，这6个样本的观测物种数为476～ 2 047 种；6个样本的Chao 1指数从大到小的排列为：DB>DL>CL>CB>CH>DH，这与观测物种指数稍有不同，数值在 756.394 2～2 351.972 之间。香农多样性指数从大到小的顺序为DB>CL>CB>DL>DH>CH，数值在1.56～6.88之间。

从表2可以看出，尽管采自于不同的生境，亮鳞杜鹃2个样本(DH、CH)的观测物种数(476、483)以及chao 1指数(756.39、882.00)均非常接近，表明这2个样本具有最接近的真实物种数；此外，从香农多样性指数上看，这2个样本也具有最接近的指数(1.68，1.56)，而其余4个样本指数均在3.11以上，说明亮鳞杜鹃2个样本的微生物多样性均同样分布极不均匀。因此，对于亮鳞杜鹃来说，不同的生境并未对其根际微生物的Alpha—多样性造成差别。

对乳黄杜鹃的DL与CL样本来说，在观测物种数上， DL/CL = 0.86；在Chao 1指数上，DL/CL = 1.09；而在香农多样性指数上，DL/CL = 0.70。因此在Alpha—多样性上，乳黄杜鹃不同生境的2个样本不像亮鳞杜鹃的样本那么相似，可能由于生境的不同而产生部分影响。

锈红毛杜鹃则显示出与亮鳞杜鹃样本不同的Alpha—多样性格局。从表2可以看出，锈红毛杜鹃的DB与CB样本存在较大差异，在观测物种数上， DB是CB的2.29倍；在Chao 1指数上，DB是CB的2.09倍；在香农多样性指数上，DB是CB的1.91倍。这种差异已超越了不同种样本间的差异，可能是由于生境的不同而导致。

2.4 根际土壤微生物的Beta—多样性指数

在韦恩图中，根据样本间OTUs交叠情况，可以分析不同样本共有与特有的OTUs数目。本研究中分别对同一物种的2个样本(图5，A、B、C)，不同生境3种杜鹃的3个样本(图5，D)以及同一生境3种杜鹃的3个样本(图5，E)进行韦恩图分析。

在同一物种的不同2个样本间可以看到，乳黄杜鹃和亮鳞杜鹃的各自2个样本间共享的OTUs的比例分别为33.1%和37%(图5，A、B)，而锈红毛杜鹃的2个样本这一比例仅为12.3%(图5， C)。不同生境3种杜鹃的3个样本间共享的OTUs的比例为8%， 这3个样本两两之间共享的OTUs的比例分别为15%(DL-DB)、12.2%(DL-DH)和12.2%(DH-DB)(图5， D)。尽管同生于一处，但3个样本共有的OTUs的比例为11.5%(图5，E)，小于所有的同一物种的不同生境2个样本间的共享比例。这说明同一物种尽管可能分布在不同的地方，其根际微生物群落中还是有相当比例的物种特异性的微生物，这个比例比共生一处的不同种间共享的微生物种类比例要高。

图5 土壤样本的根际微生物群落OTUs交叠韦恩图 Fgi.5 Venn diagram of OTUs overlapping of rhizosphere microbial community in soil samples

2.5 样本聚类分析

聚类分析可以进一步判断样本间的相似性，距离数值越小，则表明样本间越相似。使用层次聚类方法，对6个样品间距离进行计算，这6个样本在距离为0.58处聚成4组(图6)。来自亮鳞杜鹃不同生境的CH和DH以0.4的距离聚为一支，乳黄杜鹃不同生境的DL和CL距离为0.5，但仍然聚为一支，说明亮鳞杜鹃和乳黄杜鹃的物种相同，微生物的种群格局就非常类似。锈红毛杜鹃不同生境的2个样本则未能聚在同一支，说明对锈红毛杜鹃来说，不同生境对其微生物生态格局影响大，尽管物种相同，但其根际微生物多样性格局并不相似。

3 结论与讨论

3.1 物种是根际微生物群落结构的重要影响因素

亮鳞杜鹃和乳黄杜鹃的土壤样本分析表明，物种对根际微生物群落结构影响非常大。来自门、科、属3个分类水平上的群落结构表明，两者非常相似，即亮鳞杜鹃2个不同生境的样本具有类似的群落内部结构。在Alpha—多样性方面的3个参数上(观测物种数、Chao 1指数、香农多样性指数)，亮鳞杜鹃2个不同生境的DH与CH样本的差别也不大。Beta—多样性分析进一步表明了亮鳞杜鹃不同生境的2个样本群落结构的相似性， DH和CH 2个样本间共享的OTUs比例为37%，这个共享比例已超过同一生境的不同种3个样本之间(CH、CL、CB)共享的OTUs比例(11.5%)。聚类分析表明，DH和CH以0.4的距离聚为一支，而包括CH、CL、CB的一支最近距离达到0.6，说明物种对亮鳞样本根际微生物群落结构的影响更大。乳黄杜鹃2个不同生境的DL与CL样本的相似性则要小一些，其Alpha—多样性指数并非特别接近，但是Beta—多样性分析表明(韦恩图分析、聚类分析)，DL与CL样本间比其它任何样本都要相似。

根系分泌物能影响根际微生物群落结构，这是因为植物通过排出根系分泌物，使土壤环境发生变化，进而影响土壤微生物群落结构[5]。在本研究中，尽管亮鳞杜鹃的DH和CH，以及乳黄杜鹃的DL和CL采自于不同生境，但由于同种植物的根系分泌物的成分比较稳定，因此同一物种的植物仍然可以通过相似的根系分泌物使不同生境中的根际微生物的组成与结构趋于一致。

3.2 生境会影响部分物种的根际微生物群落结构

锈红毛杜鹃的2个样本(DB、CB)则显示出不一样的根际微生物群落结构。从群落组成上看，在门的分类水平上， DB与CB在优势菌门上存在明显差异。CB的优势菌门均为变形菌门和厚壁菌门，而DB的优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门。在科、属的分类水平上，2个样本的差异同样明显。从Alpha—多样性看，锈红毛杜鹃的DB与CB样本同样存在较大差异，在观测物种数、Chao 1指数、香农多样性指数3个参数上，DB分别是CB的2.29倍、2.09倍、1.91倍。从Beta—多样性看，DB和CB共享的OTUs仅为12.3%，远远小于乳黄杜鹃和亮鳞杜鹃的2个样本的共享比例，仅仅比同一生境中3种杜鹃的3个样本(CH、CL、CB)的共享比例(11.5%)稍大。聚类分析表明，DB和CB并未能单独聚为一支，这说明两者之间的差异已大于种间的土壤样品的差异，DB、CB这2个样本间的差异是由生境的不同而导致的。

生境不同，特定微生物群落结构就不一致[16-17]。如在农田生态系统中，不同的土地利用方式能显著影响微生物多样性[18]，在牧区中，微生物种类会随草地退化程度增高而减少[19]。DB在这6个样本中的特殊性很值得关注，这个样本采集于轿子山海拔 3 760 m处腐殖质非常丰富的生境。微生物多样性与土壤有机质含量直接相关[20]，这可能是导致DB的Alpha—多样性非常高的原因。

综上所述，物种和生境对植物根际微生物群落结构均产生影响。在环境基本类似时，物种决定了微生物的群落结构，而在生境差异较大时，同一物种不同生境的微生物群落结构可能有较大差异。