电针对绝经后骨质疏松患者血清BGP、DKK-1、OPG和OPN 水平的影响*

★ 郑雪峰 聂焱 何庆建 林燕萍*（1.福建中医药大学针灸学院 福州 3501；.福建中医药大学附属福州市中医院 福州 350001）

世界卫生组织将骨质疏松症（osteoporosis，OP）定义为：是多种原因引起的一组骨病，出现以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变，导致该症患者的骨密度和骨质量下降，从而出现骨骼疼痛、易于骨折的全身性骨病［1］。绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）主要发生在绝经后妇女，其病因可能是由于卵巢功能减退、雌激缺乏所致骨量减少及骨组织结构变化的全身代谢性骨病［2］。临床常以周身疼痛、继发性骨折为主要表现，其危害性为易骨折，致残率高，严重危害绝经后妇女的身体健康和生活质量，甚至缩短寿命。全球范围内估计有大约2 亿女性受到骨质疏松症的困扰，女性患病后骨量以平均每年约3%的速度急剧下降，约持续5～10 年的时间［3］，与绝经相关的骨质疏松症增加了社会劳动力的损失与患者家庭的人力负担。该症现已成为严重的公共健康问题，临床上急需针对性更强、不良反应更少的合理治疗方法。针灸作为中医学常用的外治法，在临床中有其独特的优势。临床研究表明，针灸能有效缓解临床中PMOP 患者的骨痛症状，改善及调节骨代谢，促进人体对肠钙的吸收及利用率，增加血清骨钙水平，从而利于骨的形成［4］。此外，在临床应用中，可同时施灸多个穴位，具有方便经济、不良反应少、患者接受度高等优点。

本课题组经过长期临床实践，发现电针治疗PMOP 的疗效确切，可明显降低患者的骨痛症状。因此，本研究根据以往临床治疗经验及文献的调查统计，确立以“补肾健脾”为基本治法，选取脾俞、肾俞穴，旨在观察电针治疗对PMOP 患者的骨密度和骨痛症状的影响，检测治疗前后血清中特异性骨代谢指标——骨钙素（BGP）、糖蛋白Dickkop（DKK-1）、骨保护素（OPG）和骨桥蛋白（OPN）的表达水平变化，初步探究电针背俞穴对患者骨代谢过程的影响，从而为临床研究电针治疗PMOP 的作用机制提供一定的参考依据，丰富防治本病的手段，以期寻求安全、方便、切实有效的中医特色外治方法。

1 资料

1.1 一般资料 选取2017 年1 月1 日—12 月31 日期间，在福建省立医院就诊的30 例绝经后骨质疏松患者为观察对象，年龄45～75 岁，平均年龄（56.64±3.56）岁，病程1～20 年，平均绝经时间（5.52±0.88）年，体重指数（23.95±1.78）kg/m2。本研究通过本院伦理委员会审查。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准专家共识（第三稿）》［5］，结合中国老年学会骨质疏松委员会（OCCGS）制定的标准，其中，将我国汉族妇女使用DEXA 测得的股骨Neck 骨密度，以低于峰值骨量2 标准差（-2.0 SD）作为诊断标准，见表1。

表1 OCCGS骨质疏松诊断标准

1.2.2 中医诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则》［6］中骨质疏松症的中医证候（脾肾亏虚证）诊断标准。主症：腰背疼痛和（或）下肢疼痛，酸软少力，步履艰难。次症：畏寒喜暖，形体肥胖，纳差腹胀，便溏，舌淡胖，苔白滑，脉沉弱或沉迟。

1.3 纳入标准 （1）符合上述中西医临床诊断标准；（2）年龄45～75 岁，籍贯为福州地区，已绝经且病程至少1 年以上的妇女；（3）思维清晰、沟通良好、依从性好，能够配合相关临床资料的收集；（4）自愿加入该临床研究并签署知情同意书。

1.4 排除标准 （1）近期服用其他有关治疗药物，不能立即停用者；（2）有支气管哮喘病史者；（3）有代谢性疾病或肿瘤，如甲亢、多发性骨髓瘤及合并其他疾病造成的骨质疏松症；（4）骨质疏松晚期畸形、残疾、失去劳动力者；（5）合并有心脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病及精神病患者；（6）过敏体质，对本研究药物过敏者。

1.5 医学伦理控制 患者纳入临床研究时，研究者详细告知患者及家属目前的病情，包括西医诊断、中医诊断及证型、疾病发生的可能机制、研究将采取的方案，告知治疗项目的操作流程及可能出现的不良反应，以及如何防治不良反应，告知受试者的权利和治疗的必要性，并留下患者家属的电话、地址或身份证复印件等资料，以便追踪复査及提醒继续治疗，避免失访。当患者治疗后感觉不适时，及时电话联系、剔除施治方案，以避免机体伤害，杜绝医疗纠纷发生。

2 方法

2.1 治疗方法

2.1.1 取穴 双侧脾俞、肾俞穴。定位：脾俞穴位于胸腰部，第十一胸椎棘突下，旁开1.5 寸处；肾俞穴位于腰部，第二腰椎棘突下，旁开1.5 寸处。具体参照2007 年6 月石学敏主编的《针灸学》第2 版教材。

2.1.2 器具 统一采用华佗牌一寸半针灸针（规格：0.30 mm×40 mm，产品注册证号：苏食药监械（准）字2012 第2270864 号）及华佗牌（SDZ-Ⅱ型）电子针疗仪。

2.1.3 操作 受试者取坐位，脾俞、肾俞穴所在区域常规消毒，安定患者情绪，调整患者呼吸。一手持针柄，一手持消毒棉球夹持针身对准穴位，采用弹针手法，垂直进针（深度根据患者体型调整），透皮后予以提插捻转行针手法，待得气后，行捻转补法操作。同侧脾俞和肾俞穴处各连接一组输出导线：脾俞穴连接正极（+），肾俞穴连接负极（-），均采用2 Hz 疏密波，电流强度大小以患者能耐受为度，持续时间20 min/次，每日行电针治疗1 次，连续针刺10 次为一疗程，疗程间休息5 d，再行下一疗程，共针刺6 个疗程，持续90 d。

2.2 观察指标

2.2.1 骨密度测定 所有研究对象均采用美国Hologic Explorer 双能X 线骨密度仪（DEXA）检测腰椎正位（L1-L4）及左髋关节股骨颈部（Neck）的骨密度（BMD）变化，并记录其相应值。电针治疗前后各检测1 次。

2.2.2 临床骨痛评分 于电针治疗前后，根据视觉模拟评分法（VAS）对患者的骨痛症状进行评分。VAS 量表是一条长10 cm、均分为10 等份（标有10 个刻度）的标尺，从左至右依次标记为0-10，0分表示症状最轻，10 分表示症状最严重，让患者在标尺上指出与自身疼痛程度相当的位置，该位置相应数值即为患者的疼痛分数。

2.2.3 蛋白水平检测 所有研究对象均于开始治疗的前一天和治疗结束后的第二天隔夜禁食12 h，于次日清晨空腹抽取外周肘静脉全血5 mL，低温高速离心（12000×g，20 min，-4 ℃），取血清。SDS-PAG 电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入BGP、DKK-1、OPG 和OPN 一抗（稀释比例均为1∶1000），4 ℃冰箱中孵育过夜，次日用TBST 洗涤后加入HRP 标记的第二抗体（稀释比例均为1∶5000），室温下孵育2 h 后TBST 洗涤。加入ECL 显色剂，使用凝胶成像分析系统曝光显色，分析目标条带出现的灰度值，将目标蛋白和β-actin的灰度值的比值作为目标蛋白的相对量，比较每组之间的差异。

2.3 统计学分析 使用SPSS 16.0 软件处理分析。所有计数资料及数据均用平均值±标准差（）表示。治疗前后指标采用两样本t检验进行比较。P<0.05 表示统计学差异有显著性，P<0.01 表示统计学差异有极显著性。

3 结果

3.1 治疗前后骨密度和临床骨痛积分比较 见表2-3。经电针治疗后，PMOP 患者BMD 值与治疗前相比无统计学意义（P>0.05）；VAS 临床疼痛评分显著降低，且具有显著性差异（P<0.01），说明电针背俞穴能够降低PMOP 患者的VAS 分值，能在一定程度上改善其骨痛症状。

表2 治疗前后腰椎正位（L1-L4）及左股骨Neck骨密度比较（） g/cm2

表2 治疗前后腰椎正位（L1-L4）及左股骨Neck骨密度比较（） g/cm2

注：治疗后与治疗前相比无显著性差异（P＞0.05）。

表3 治疗前后VAS临床骨痛评分比较（） 分

表3 治疗前后VAS临床骨痛评分比较（） 分

注：与治疗前比较，*P＜0.01。

3.2 治疗前后血清BGP、DKK-1、OPG 和OPN 蛋白表达比较 见图1-2。经对比，患者经1 个疗程的电针治疗后，血清中OPG 表达显著上升、DKK-1表达显著下降（P<0.01）。而BGP 和OPN 在血清中的表达量变化无统计学意义（P>0.05）。

图1 治疗前后患者血清BGP、DKK-1、OPG和OPN蛋白表达比较

图2 治疗前后患者血清BGP、DKK-1、OPG和OPN蛋白光密度值比较

4 讨论

中医认为，肾精不足是造成骨质疏松症的首要病机。“肾为先天之本”“肾主骨生髓”，说明骨的生长、发育和质量无不与肾密切相关［7］。《素问·逆调论篇》：“肾不生，则髓不能满；肾气热则腰脊不举……”论述了骨髓与肾之间的病理联系，即肾精充足，则骨髓生化有源；肾精不足，则骨髓失养。脾虚同样也是造成骨质疏松症的重要病机之一。脾主肌肉、四肢，为气血生化之源，《灵枢·决气》云：“谷入气满，淖泽注于骨。”说明脾胃健康对于维持人体骨的正常机能十分关键。女性绝经期前后，正是《内经》所述天癸竭之时，此时肾气衰弱，脾胃运化功能减退，以致气血乏源，故见骨髓生化不足，骨骼脆弱无力，易于骨折，并伴有肾精亏虚、脾胃虚弱等症。因此，本研究基于PMOP 的病因病机，经课题组临床研究和文献调查统计［8-9］，发现电针疗法可以有效改善绝经后骨质疏松症患者的临床症状，并延缓骨质疏松症的进程。肾俞穴有壮腰益肾、疏经止痛之功，既可滋阴益肾，又可通经活络。脾俞穴为脾经经气输注于背部之处，选用脾俞能健脾和胃、补中益气、通经活络。选择膀胱经肾俞、脾俞穴进行电针干预治疗，以达补肾益脾、调和气血、通经活络之目的。

骨钙素（BGP），又称骨钙蛋白，是人体内含量最多的非胶原蛋白，其在健康机体的血液中含量极低，主要存在于人体骨组织。而当人体处于高骨转换状态下，BGP 能够在血液中高度表达，因此BGP能够准确灵敏的反映成骨细胞活性和机体骨转换状态。此外，众多研究均表明，绝经后患骨质疏松症妇女血清BGP 表达与骨密度、雌激素呈负相关，其原因可能与绝经后体内骨转换量增大有关［10-11］。DKK-1 作为引起人体骨量减少的重要原因之一，其过程主要涉及Wnt/β-catenin 信号通路。Wnt/βcatenin 信号通路可通过OPG 抑制骨吸收并促进新骨的形成，而DKK-1 能够与低密度脂蛋白受体5/6（Lrp5/6）、穿膜蛋白Kremen1/2 结合形成三聚体，从而阻断Wnt 配体与Lrp5/6 的结合，抑制Wnt/βcatenin 通路的活性，最终达到阻断成骨细胞分化及骨形成的目的［12］。现代医学研究中，DKK-1 不仅是评价骨质疏松的重要骨代谢指标，更是作为治疗骨质疏松新药研发的关键靶点而备受关注。OPG是一种分泌型糖蛋白，在成骨细胞、骨髓基质细胞、内皮细胞等多种细胞均有表达，具有抑制破骨细胞分化成熟的作用，从而增加骨密度。现代医学研究表明，重组OPG 可用于治疗由OPG 缺乏导致的可逆性严重骨质疏松症［13］。通过实验还发现，对卵巢切除的雌性小鼠给予一定量OPG，能够显著增加其体内骨小梁的量［14］，表明OPG 可抑制骨吸收和预防骨丢失。OPN 是骨细胞、软骨细胞、成骨细胞等细胞中高度表达的一种非胶原性骨基质糖蛋白，能够参与组织修复、骨基质的矿化和吸收过程，尤其在骨质破坏后的重建过程中有较高的表达，其原因可能与OPN 抑制骨质矿化和促进骨吸收功能有关，是骨质疏松发生的重要标志物［15］。

综上，本研究采用BGP、DKK-1、OPG 和OPN 这四种骨代谢特异性指标，作为电针背俞穴对绝经后骨质疏松症疗效的评价指标。实验结果表明，与治疗前相比，患者经1 个疗程的电针治疗后，BMD 值无显著性变化（P>0.05），VAS 临床骨痛评分显著降低（P<0.01），血清中OPG 的表达量增加、DKK-1 的表达量减少（P<0.01），而BGP和OPN 的表达量则无明显变化（P>0.05），提示电针肾俞、脾俞穴能够缓解PMOP 患者的骨痛症状，其治疗的作用机制可能与通过调控患者OPG 与DKK-1 的表达，从而抑制破骨细胞的形成与成骨细胞的分化有关。