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己糖激酶2促进人宫颈癌细胞系的迁移与增殖

2020-10-22张燕茹

基础医学与临床 2020年10期
关键词:室温细胞系激酶

雷 丹,张燕茹,陈 茜,李 露,崔 南*

(1.西安交通大学第一附属医院 生殖医学科,西安交通大学 医学部,陕西 西安710061;2.西安医学院第一附属医院 肾病科,陕西 西安 710021)

在发展中国家,宫颈癌(cervical cancer)是位居第2的一种女性致死性癌,在全球范围内,宫颈癌也是排名第4的肿瘤类型。近年来的研究显示,宫颈癌呈现年轻化倾向, 25岁以下罹患宫颈癌的年轻女性患者逐渐增多[1-2]。

在肿瘤细胞中,即使在氧供充足的情况下,细胞内相当一部分的葡萄糖仍会跳过氧化磷酸化途径通过糖酵解途径生成丙酮酸后直接生成乳酸,从而为肿瘤细胞增殖提供能量,该现象称之为Warburg效应。肿瘤细胞通过采用这种高消耗的代谢方式可以塑造有利于自身增殖的环境,利于肿瘤细胞的存活、快速增殖及肿瘤细胞的迁移和肿瘤的转移[3]。己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)是己糖激酶(hexokinase,HK)同工酶的一种,通过结合位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel, VDAC)蛋白,HK2可以加快糖酵解的进程,为肿瘤细胞增殖提供大量的原料,与肿瘤细胞内异常糖酵解过程密切相关[4]。既往的研究证实,HK2在头颈部麟癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和恶性淋巴瘤等多种肿瘤组织中表达升高。应用HK2抑制剂如3-BP可抑制多种肿瘤细胞的增殖,如人胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和肝癌细胞等[5]。但是HK2在宫颈癌中的研究仍较少。因此,本研究拟在宫颈癌细胞系HeLa细胞中过表达HK2后,观察HK2对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨HK2通过p-ERK1/2上调周期相关蛋白cyclin A和Slug表达促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭作用机制,研究HK2对宫颈癌细胞系HeLa细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系HeLa 细胞、SiHa、C-33A和CaSki(ATCC)。质粒表达载体pCAG-IRES2-AcVEC-neo(本实验室保存)。HK2、cyclin A、ERK1/2和GAPDH鼠单克隆抗体(Santa Cruz公司);Slug和p-ERK1/2兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司);DMEM培养基(上海源培生物科技有限公司);胎牛血清(Biological Industries公司);Trizol试剂、反转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司);其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 G418压力筛选获取稳定表达HK2蛋白的HeLa细胞系:将人宫颈癌细胞HeLa培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,于5% CO2的37 ℃孵箱中常规培养。将2 μg重组质粒DNA通过Lipofectamine 2000脂质体转染试剂转染于细胞中,G418压力筛选3~4周后,通过Western blot,鉴定HK2表达阳性的单克隆细胞系。

1.2.2 细胞免疫化学检测蛋白表达:常规消化对数期的细胞后制备成细胞悬液,接种于0.5 cm×0.5 cm的爬片上, PBS洗涤5 min×3次,4%多聚甲醛室温固定30 min。PBS 洗涤5 min×3次,加入0.2% Triton X-100,室温放置10 min。PBS 洗涤5 min×3次后,加一抗,4 ℃湿盒过夜。次日,室温放置30 min,PBS 洗涤5 min×3次,加二抗,室温放置30 min。PBS洗涤5 min×3次后,DAB显色,依次使用:苏木精染色2 min,盐酸乙醇分化15 s,氨水反蓝15 s,梯度乙醇脱水各5 min,二甲苯透明2 min,中性树胶封片,光学显微镜下观察。

1.2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移:将细胞接种于6孔板中至90%~95%汇合度,用20 μL无菌枪头划一横线,PBS清洗细胞3次,加入无血清的DMEM培养基继续培养24 h,用倒置显微镜进行观察及拍照,选取5个视野进行统计分析。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭:将HeLa细胞饥饿24 h后,将4×105个细胞加入Transwell上室中,下室中加入含 10% FBS的DMEM培养基, 37 ℃孵育。48 h后,用棉签擦去上室内残留的细胞,甲醛固定10 min,0.1%的结晶紫室温孵育10 min, PBS清洗3遍,将小室底面朝上于显微镜下拍照,随机选取5个视野进行计数,统计分析,重复上述实验3次。

于Transwell上室中平铺1∶8的matrigel胶50 μL,紫外灯照射消毒6 h后,将细胞悬液加入Transwell上室,下室中加入10% FBS 的DMEM培养基,后续步骤同体外迁移实验。

1.2.5 细胞计数法和MTT法检测细胞增殖:将细胞用胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液,按照3×104个/皿接种于6孔板里。分别于1、3、5和7 d,进行细胞计数,绘制细胞增殖曲线,每组试验设置3个复孔,重复3次。将细胞制成单细胞悬液,以1 000个/孔接种于96孔培养板中。于接种后1、3、5和7 d,用MTT法检测各组吸光度A值,各实验组均设置3个复孔,实验重复3次。

1.2.6 细胞周期分析:胰蛋白酶消化收集细胞,1 000 r/min离心5 min,预冷的PBS洗涤2次,加入预冷的70%乙醇,4 ℃冰箱固定细胞。1 000 r/min离心5 min, PBS洗涤2次。0.01% RNase的PI处理细胞,4 ℃避光染色30 min。流式细胞仪进行检测,使用CellQuest软件分析结果。重复试验3次以上。

1.2.7 Real-time PCR检测细胞mRNA表达:使用Trizol试剂提取细胞的总RNA,按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA,以NCBI Gene bank提供的人基因序列为模板设计特异性real-time PCR引物(表1)。Real-time PCR按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行。将各管混匀离心后,置于Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪中进行扩增反应。每个样品准备3个复管,试验至少重复3遍。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.8 Western blot检测蛋白表达:使用细胞裂解液收集细胞蛋白,测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白,电泳结束后,进行转膜;5%的脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭1 h;加入一抗,4 ℃孵育过夜;次日,TBST洗膜10 min×4次;加二抗室温孵育1 h;TBST洗膜10 min×4次;化学发光检测;通过Western blot化学发光成像一体机拍照分析。

1.2.9 抑制p-ERK1/2蛋白在HK2过表达HeLa细胞中表达:ERK1/2抑制剂(FR180204)按照说明书溶于DMSO,后续根据实验需要稀释至工作浓度30 μmol/L和60 μmol/L。将细胞培养液更换为含FR180204培养液后:分别进行细胞计数、MMT、Transwell体外迁移实验和侵袭实验;收集细胞,加入细胞裂解液收集细胞蛋白,通过Western blot检测相关蛋白表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HK2蛋白在宫颈癌细胞中的表达

HK2蛋白在宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa中均有表达(图1A,B)。在线数据库的结果显示,HK2蛋白在宫颈癌组织中的表达高于正常组织(图1C)(P<0.05),且HK2高表达提示患者不良预后(图1D)(P<0.01)(gepia.cancer-pku.cn)。成功构建稳定表达HK2蛋白的HeLa-HK2-2和HeLa-HK2-3细胞系,及对照细胞系HeLa-VEC-1和HeLa-VEC-2 (图1E)。

A.expression of HK2 in cervical cancer cell lines was detected by Western blot; B. expression of HK2 in cervical cancer cell lines was detected by immunocychemistry; C.expression of HK2 between cervical cancer patients CECS and normal tissues(N) was analyzed by online database, *P<0.05 compared with VEC control group; D.overall survival between HK2-high patients and HK2-low patients was analyzed by online database; E.expression of HK2 in stable transfected HeLa cell was detected by Western blot图1 HK2在宫颈癌细胞系中的表达Fig 1 Expression of HK2 in cervical cancer cell lines n=3)

2.2 HK2增强HeLa细胞体外迁移和侵袭的能力

与对照细胞相比,过表达HK2显著增强HeLa细胞体外迁移(图2A)(P<0.05)和侵袭的能力(图2B)(P<0.05)。细胞划痕实验也发现,在观察48 h时,HeLa-HK2细胞划痕的愈合速度快于HeLa-VEC细胞(图2C,D)(P<0.05)。

A. migratory potential of HK2-overexpressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed by the Transwell cell migration assay, and number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; B.invasive potential of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed by the transwell cell invasion assay, and the number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; C.migratory potential of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells was analyzed in a wound-healing assay for 0 and 48 hours(×200); D.scratch area of HK2-over-expressing HeLa cells and the respective control cells; *P<0.05 compared with VEC control group图2 HK2促进HeLa细胞的体外迁移和侵袭Fig 2 HK2 promoted HeLa cell migration and invasion in n=3)

2.3 HK2促进HeLa细胞的增殖和细胞活力

HK2可以显著促进HeLa细胞的增殖(图3A)(P<0.05)和细胞活力(图3B)(P<0.05)。HK2可以加快细胞周期从G0/G1期向S期的转换。HeLa-HK2细胞中处于G0/G1的细胞比例明显少于HeLa-VEC细胞,HeLa-HK2细胞中处于S期的细胞比例明显多于HeLa-VEC细胞(图3C,D)(P<0.05)。

A.proliferation of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells were detected by growth curves; B.viability of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells were detected by MTT assay; C,D.cell cycle of HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was analyzed by flow cytometry, and the quantitative analysis;*P<0.05, **P<0.01 compared with VEC control group图3 HK2促进HeLa细胞体外增殖Fig 3 HK2 promotesd cell proliferation of HeLa cells in vitro n=3)

2.4 HK2上调ERK1/2、p-ERK1/2、Slug和cyclin A蛋白表达

HK2可以上调EMT相关基因CDH2、Slug、vimentin、ZEB1和ZEB2在HeLa细胞中的mRNA的表达量(图4A)。此外,HK2可以上调周期相关蛋白cyclin A和cyclin D1在HeLa细胞中的mRNA的表达量(图4A)。HK2可以显著上调ERK1/2、p-ERK1/2、cyclin A和Slug蛋白在HeLa细胞中的表达(图4B,C)。

A. expression of CDH1, CDH2, Snai1, Slug, vimentin, ZEB1, ZEB2, HK2, cyclin D1, cyclin A, HK2 HeLa-Vec and HeLa-HK2 cells was detected by real-time PCR, and the quantitative analysis was shown; B.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug, cyclin A in HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was detected by Western blot, and the quantitative analysis was shown; C.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Snai2, cyclin A in HeLa-VEC and HeLa-HK2 cells was detected by immunocychemistry (×100); *P<0.05,**P<0.01 compared with VEC control group图4 HK2上调HeLa细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Slug和cyclin A蛋白表达Fig 4 HK2 up-regulated expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug and cyclin A in HeLa n=3)

2.5 抑制ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达可以减弱HK2对HeLa细胞增殖及迁移的影响

FR180204可以显著抑制ERK1/2、p-ERK1/2、cyclin A和Slug蛋白的表达(图5A)。FR180204可以抑制HeLa-HK2细胞的增殖和活力(图5B,C)。FR180204 可以抑制HeLa-HK2细胞体外迁移和侵袭能力(图5D,E)。

A.expression of ERK1/2, p-ERK1/2, Slug and cyclin A was detected by Western blot in FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells, and the quantitative analysis was shown; B.proliferation of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells were detected by growth curves; C.viability of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells were detected by MTT assay; D.migratory potential of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells was analyzed by the transwell cell migration assay, and number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; E.invasive potential of FR180 or DMSO treated HeLa-HK2 cells was analyzed by the transwell cell invasion assay, and the number of migratory cells was shown, scale bar=100 μm; *P<0.05,**P<0.01 compared with DMSO control group图5 抑制ERK1/2 蛋白表达可以减弱HK2对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响Fig 5 Treating with the ERK1/2 inhibitor could inhibite cell growth, migration and invasion that induced by HK2

3 讨论

己糖激酶2 (HK2)是己糖激酶的一员,是糖酵解的一种关键酶,与恶性肿瘤关系最密切[6-8]。在本研究中,Western blot和细胞免疫化学的结果显示,在宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa中均可检测到HK2蛋白的表达。在线数据库中的数据也证实HK2在宫颈癌患者标本中的表达明显高于正常组织标本,且HK2高表达提示患者的不良预后。

HK2通过增强肿瘤细胞的Warburg效应,可以促进细胞增殖并抑制细胞凋亡[9]。在本研究中,HK2表达可以上调细胞周期相关蛋白cyclin A和cyclin D1在HeLa细胞中mRNA的表达。Western blot和细胞免疫化学的结果证实,HK2可以显著上调cyclin A在HeLa细胞中的表达。cyclin A作为调节细胞周期进程的一个正向调节分子可以促进多种肿瘤细胞的增殖及肿瘤的生长,在本研究中,HK2通过上调cyclin A在HeLa细胞中的表达可以促进HeLa细胞的体外增殖和细胞活力。此外,real-time PCR和Western blot的结果显示,HK2通过上调多种EMT相关分子在HeLa细胞中mRNA和蛋白的表达,如CDH2、Slug、vimentin、ZEB1和ZEB2,增强HeLa细胞体外迁移和侵袭的能力。

ERK1/2是MAPK信号传导通路激酶级联反应的重要成员之一,ERK1/2经过磷酸化活化后,通过调节下游多种因子的表达(如cyclin A和Slug)参与调节肿瘤细胞的增殖、 侵袭及肿瘤转移[10-13]。在本研究中,HK2可以显著上调ERK1/2和p-ERK1/2在HeLa细胞中的蛋白表达。在HK2过表达HeLa细胞中用ERK抑制剂(FR180204)抑制ERK1/2和 p-ERK1/2表达后,可以下调cyclin A和Slug蛋白的表达,并抑制HK2对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。上述结果提示,HK2通过上调ERK1/2和p-ERK1/2在HeLa细胞中的表达可以促进细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述,本研究发现HK2在宫颈癌中通过活化ERK1/2(p-ERK1/2),可以上调cyclin A和Slug蛋白的表达,并促进HeLa细胞的体外增殖、迁移和侵袭。但是,HK2通过何种方式上调ERK1/2蛋白表达并增强ERK1/2的活化(p-ERK1/2),仍有待通过进一步的研究去证实。

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