HPLC 测定北芪五加颗粒中紫丁香苷的含量

2020-10-22赵留涛陈五常韩冰倩袁之润吴冠连吴洪银吴春丽

中国兽医杂志 2020年5期

赵留涛，陈五常，韩冰倩，袁之润，吴冠连，吴洪银，张坤，吴春丽,4

(1.郑州大学药学院，河南郑州 450001；2.商丘爱己爱牧生物科技股份有限公司，河南虞城 476300；3.郑州爱己爱牧生物技术有限公司，河南郑州 450001；4.郑州市新型兽药制剂创新重点实验室，河南郑州 450001)

北芪五加颗粒有补中益气、扶正祛邪的功效，用于提高禽机体免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。北芪五加颗粒处方由黄芪和刺五加2味药材组成，其中具有益气健脾、补肾、安神功效[1]。现代药理学研究表明，刺五加具有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、抗辐射等作用[2]；刺五加主要含有刺五加总苷，包括紫丁香苷、异嗪皮啶和刺五加苷E等成分[3-4]。本试验参考了有关文献[5-8]，以紫丁香苷为指标，采用高效液相色谱法(HPLC)测定其含量，测定北芪五加颗粒中紫丁香苷的含量，为其质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；METTLER TOLEDO AB135-S万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。紫丁香苷对照品 (中国食品药品检定研究院，批号：111574-200603，规格：供含量测定用)；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件色谱柱phenomenex 00G-4435-E0(250 mm×4.60 mm×5 μm)；流动相：甲醇-水 (20∶80)为流动相；检测波长为265 nm。理论板数按紫丁香苷峰计算不低于2 000。

1.2.2 紫丁香苷对照品溶液的制备精密称取紫丁香苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL中含紫丁香苷20 μg/mL的溶液，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备取本品适量，研细，取5.0 g，精密称定，置小烧杯中，用50%甲醇40 mL，分次溶解，转移至50 mL的容量瓶中，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)10 min，取出，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

1.2.4 阴性对照溶液制备依据处方中的比例，按制法制备缺刺五加的阴性对照样品，按1.2.2项操作制备阴性对照溶液。按照上述色谱条件，分别注入色谱仪测定，结果阴性样品色谱在与紫丁香苷峰相应的保留时间附近无干扰峰检出。

1.2.5 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算，即得。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性考察照上述1.2.1项下色谱条件，分别精密吸取阴性对照溶液 10 μL、供试品溶液 10 μL、对照品溶液 10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，阴性对照溶液在紫丁香苷对照品相应的保留时间处无干扰，见图1、图2、图3。

图1 阴性对照色谱图Fig.1 HPLC of negative control

2.1.2 线性关系考察精密称取紫丁香苷对照品适量，分别制成浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的对照品溶液，分别进样测定，进样量10 μL，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，紫丁香苷浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，Y=0.421 6X-0.054 2，相关系数R2=0.999 9，不小于0.999。试验结果见表1。结果表明，紫丁香苷在5.05 μg/mL～80.75 μg/mL范围内，呈线性关系，结果见图4。

图2 紫丁香苷对照品色谱图Fig.2 HPLC of syringin reference

图3 紫丁香苷供试品色谱图Fig.3 HPLC of syringin for the test sample

图4 紫丁香苷标准曲线Fig.4 Standard curve of syringin

2.1.3 精密度试验精密吸取紫丁香苷对照品溶液 10 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样 6 次，测得紫丁香苷峰面积RSD为0.09%，结果表明，本方法精密度良好。

2.1.4 重复性取同一批号供试品，按供试品溶液制备方法制备6份供试液，分别进样测定紫丁香苷峰面积，并分别计算紫丁香苷含量和含量的相对标准偏差，RSD为1.85%，小于2.0%。结果显示，所建立方法的重现性良好。

2.1.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24 h时测定紫丁香苷峰面积，并分别计算含量和含量的相对标准偏差，RSD为1.88%，小于2.0%，表明24 h内供试品溶液中紫丁香苷的含量基本稳定。结果显示，制备的供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.6 回收率取同一批号已知含量供试品(紫丁香苷含量181.44 μg/g)20 g，研细，混匀，取2.5 g，精密称定，共取6份，分别加入紫丁香苷对照品储备液1 mL，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样量10 μL，测定紫丁香苷峰面积并计算紫丁香苷含量，再计算加样回收率，测得平均回收率为100.43%，RSD为1.18%。表明方法准确度良好，结果见表1。

表1 加样回收率试验Table 1 Recovery rate of samples (n=6)

2.1.7 样品含量测定取20110201、20110202和20110203三个批号供试品，按照1.2.5项下的方法制备供试品溶液并测定，计算紫丁香苷的含量，含量分别为179 μg/g、180 μg/g、184 μg/g。

3 讨论

3.1 供试品处理方式的选择通过比较水、甲醇、50%甲醇、乙醇为提取溶剂，结果采用50%甲醇作为提取溶剂提取效果最好。考察了超声处理 10 min、20 min、30 min、1 h，结果表明，超声30 min紫丁香苷基本提取完全且杂质相对较少，故供试品的提取方法超声 30 min。

3.2 测定波长的选择紫丁香苷在223 nm、265 nm处有最大吸收，考察发现在265 nm下紫丁香苷即使保留时间较短，也不存在干扰峰，其他杂质峰较少，图谱效果好，故选择检测波长为 265 nm。并参考有关文献[9-11]，紫丁香苷在 265 nm处有最大吸收，且紫丁香苷峰无干扰，故选择 265 nm为检测波长。

3.3 流动相的选择参照文献[12-16]等试验研究中HPLC法测定紫丁香苷的流动相，结果表明，流动相为甲醇∶水(20∶80)时，则分离度明显提高，且紫丁香苷的峰形较好，与相邻峰能达到基线分离。