基于鲜味氨基酸的扒鸡老汤品质标准化与稳定性研究

薄存美，刘登勇,2*，王笑丹，张庆永

1(渤海大学 食品科学与工程学院, 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心, 辽宁 锦州，121013) 2(江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京，210095) 3(吉林大学 食品科学与工程学院，吉林 长春，130062) 4(山东德州扒鸡股份有限公司，山东 德州，253003)

扒鸡是中华传统的地方特色美食，因其鲜香滑爽、撕丝相连的特点[1]而深受消费者喜爱，是我国最具代表性烧鸡类产品之一。扒鸡老汤对产品滋味贡献度较大，是决定产品品质的重要因素[2]。老汤是由香辛料和调味料加水熬制而成的新汤发展而来，新汤经过多年煮制，其中的滋味物质逐渐达到稳定，从而实现肉-汤传质平衡，对产品品质的稳定性产生重要影响[3]。老汤的滋味贡献包括鲜味贡献和咸味贡献，其中鲜味主要来源于老汤煮制过程中肉类降解的鲜味物质以及肉-汤中鲜味成分相互渗透达到传质平衡。SASAKI等[4]、NISHIMURA等[5]和PONJNE等[6]分别对猪背景长肌、鸡汤和通心粉等产品鲜味物质进行研究，发现鲜味成分有助于提高产品的美味口感。

近年来，对扒鸡老汤滋味方面的研究主要包括循环卤制次数[2]和不同卤煮阶段[7]含量变化规律的研究，对老汤标准化与稳定性相关方面的研究较少。鲜味氨基酸(包括谷氨酸和天冬氨酸)作为老汤中的典型鲜味代表物质之一，是老汤鲜味贡献的重要来源[8]，其含量变化可直接反映老汤品质的变化，因此实现其含量的实时监测对产品的标准化与稳定性状态至关重要。本课题组前期研究以液相色谱检测结果为标准，研究得出了适于N，N′-二苯基硫脲膜修饰传感器快速、准确检测扒鸡老汤中鲜味氨基酸(包括谷氨酸和天冬氨酸)含量的最佳样品前处理方式[9]。

本研究以扒鸡煮制老汤为研究对象，对不同煮锅、不同卤煮批次老汤中鲜味氨基酸含量变化进行探究，并将高效液相色谱检测结果作为标准，将膜修饰传感器检测结果与之进行比较，以期能够为扒鸡产品品质标准化与稳定性研究提供参考，并为N，N′-二苯基硫脲膜修饰传感器在实际工厂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

材料：扒鸡老汤，山东德州扒鸡股份有限公司。

试剂：异硫氰酸苯酯(pheryl isothiocyrate,PITC)、三乙胺、无水乙酸钠、正己烷、冰乙酸、浓H2SO4、H2O2、正己烷、四氢呋喃、邻苯二甲酸二辛酯、聚氯乙烯、N，N′-二苯基硫脲(N，N′-diphenylthiourea,DPTU)(国产分析纯),北京索莱宝科技有限公司；谷氨酸、天冬氨酸为标准品(纯度>99%)；乙腈、甲醇(色谱纯)，美国Signna公司。

1.1.2 仪器与设备

CHI660E电化学工作站，北京壮仕科技有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津仪器公司；Allegra 64R冷冻离心机，美国Beckman公司；AL104电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；铂盘电极、铂丝电极、232型饱和甘汞电极，上海楚兮实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 取样方法

老汤样品取样后立即进行过滤处理(4层纱布，200目)，去除残余的肉渣以及其他大物质颗粒，经过滤处理后得到的老汤用真空包装袋以200 mL/袋左右的规格包装，通过手动排除法排除真空包装袋内残留的空气，密封冷冻完全，离心处理以进一步除去脂肪以及蛋白质等大分子颗粒物质，得到老汤澄清液。

为研究不同煮锅老汤中的鲜味氨基酸含量的一致化与标准化，随机选取10锅老汤进行实验，编号依次为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J。将煮锅中老汤表面的浮油撇去，取适量中间位置的老汤作为实验样品，每锅检测至少设置3个平行；随后每间隔10 d取样1次，每批次编号1、2、3、4和5，分别通过高效液相色谱和膜修饰传感器检测鲜味氨基酸含量，对老汤稳定性进行研究，并将两者检测结果进行比较。

1.2.2 液相色谱检测

标准工作溶液的配制：准确称取10.00 mg谷氨酸、天冬氨酸，用去离子水定容至10 mL，超声溶解，得到(1+1)mg/mL的谷氨酸-天冬氨酸混合标准溶液，4 ℃保存。用去离子水稀释成质量浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0和250.0 μg/mL的标准系列梯度混合溶液。

衍生化处理：参照芮鸿飞等[10]的方法并稍作修改，取500 μL上述稀释后的老汤样品，置于4 mL塑料试管中，再分别加入PITC-乙腈溶液、三乙胺-乙腈溶液各250 μL，充分混匀后在室温下放置30 min，加入50 μL乙酸(体积分数20%)充分混匀，向衍生完毕后的溶液中加入1 mL正己烷，用旋涡振荡仪振荡60 s，萃取掉剩余的衍生试剂，静置10 min分层，弃去上层正己烷溶液，用5 mL针头注射器吸出下层清液，经0.45 μm有机滤膜过滤打入2 mL液相色谱顶空瓶内，用于液相色谱检测。

色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)； 柱温40 ℃； 检测波长254 nm；流速1 mL/min； 流动相A为乙酸钠溶液，流动相B为体积分数80%乙腈溶液；流动相洗脱程序：0 min，A 92%；B 8%；2 min，A 92%；B 8%；10 min，A 90%；B 10%。

1.2.3 电极预处理

电极预处理参考朱灵涛[11]的方法并稍作修改，最终由铂盘电极、铂丝电极和饱和甘汞电极构建三电极体系，并进行后续电化学实验。

1.2.4 膜修饰传感器的制备

参照朱灵涛[11]的方法并稍作修改。膜溶液组成：5 mL四氢呋喃、0.50 mL邻苯二甲酸二辛酯、0.08 g聚氯乙烯、0.095 g DPTU。采用直接滴涂法，用移液枪准确吸取10 μL膜溶液滴涂于铂盘电极表面，自然晾干后备用。

1.2.5 标准溶液的配制

准确称取谷氨酸、天冬氨酸各14.70、13.30 mg，用去离子水分别定容至100 mL，超声至完全溶解，得到1 mmol/L谷氨酸和天冬氨酸标准溶液，4 ℃保存。临用时分别稀释成10-6、10-5.5、10-5、10-4.5、10-4、10-3.5和10-3mol/L进行膜修饰传感器电信号检测。

1.2.6 电化学传感器检测流程

扒鸡老汤(除去浮于表层的油脂)→过滤(除去香辛料碎渣、肉末等大块固形物)→取20 mL，离心(13 000×g、20 min)→取5 mL上清液→定容至100 mL→搅拌(磁力搅拌，1 h)→电化学检测

采用开路电位法进行电化学检测，参数设置为稳定时间60 s；检测时间60 s；检测间隔0.1 s；高电位+1.0 V，低电位-1.0 V。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 氨基酸检测衍生时间的选择

选用PITC-乙腈、三乙胺-乙腈溶液为样品衍生时的衍生剂，以最大浓度混标为研究对象，考察20、30、40、50和60 min等不同衍生时间对检测结果的影响。结果显示，30 min后液相色谱检测响应值结果差异不显著(P>0.05)，考虑到实验效率，选择30 min作为样品的衍生时间。

2.2 检测器柱温的选择

测器柱温的不同会对峰的形状和分离度产生影响，进而影响检测结果的稳定性[12]。考察35、40和45 ℃ 三个温度梯度对检测结果的影响，35 ℃洗脱效果不好，峰高较低，峰形质量差；40和45 ℃时均洗脱完整，40 ℃时天冬氨酸和谷氨酸的分离度分别为1.693、5.862，45 ℃时分离度分别为1.140、1.269。对高效液相色谱图而言，峰间分离度越大，说明峰的分离效果越好，峰的质量越好[13]，因此选择柱温为40 ℃进行后续试验。

2.3 氨基酸的定性分析

在流动相A为0.1 mol/L乙酸钠溶液，流动相B为体积分数80%的乙腈溶液，样品衍生时间为30 min，检测器柱温的40 ℃的条件下，天冬氨酸和谷氨酸的分离效果良好。在保证分离条件下，对流动相洗脱程序进行调整，得到最佳分离条件，洗脱程序如1.2.2小节所示，在此条件下2种氨基酸实现了基线分离。鲜味氨基酸的标准色谱图如图1所示，扒鸡老汤样品的色谱图如图2所示。

图2 老汤中鲜味氨基酸高效液相色谱图谱Fig.2 HPLC chromatogram of umami amino acids in brine

2.4 回归方程的拟合

高效液相色谱及膜修饰传感器检测标准品的线性拟合回归方程如表1所示。分别取7个浓度梯度进行线性拟合，每个梯度设置3个平行组试验，数据拟合采用平均数，使用Origin 2017软件进行拟合。

表1 线性回归方程Table 1 Linear regression equation

2.5 基于鲜味氨基酸的工业老汤标准化研究

运用本文所建立的高效液相色谱仪检测方法，以及在N，N′-二苯基硫脲膜修饰传感器检测扒鸡老汤中鲜味氨基酸含量的最佳样品前处理方式条件下，对所选取的10锅工业化老汤中的2种鲜味氨基酸含量分别进行高效液相色谱以及膜修饰传感器检测，测定结果如表2所示。偏离度按公式(1)计算:

(1)

式中:C1,液相色谱检测值,mmol/L;C2,传感器检测值,mmol/L。

表2 传感器检测理论值与高效液相色谱仪检测 实际值比较Table 2 Comparison between the theoretical value of the sensor detection and the actual value HPLC

高效液相色谱检测结果表明，不同煮锅间的谷氨酸和天冬氨酸含量存在差异性。对谷氨酸含量而言，煮锅B和煮锅J的谷氨酸含量与其他煮锅存在显著性差异(P<0.05)，其余煮锅谷氨酸含量虽存在差异，但在一定的可信度范围内总体没有显著差异性(P>0.05)。天冬氨酸的含量在不同煮锅间也存在差异性：煮锅A、C和J的天冬氨酸含量与煮锅E、F、G和H间存在显著性差异(P<0.05)，与煮锅B、D和I无显著性差异(P>0.05)。2种鲜味氨基酸含量的差异在不同煮锅间的波动不大，老汤中鲜味氨基酸含量是处于动态平衡的状态，谷氨酸和天冬氨酸含量最高的分别为煮锅H和A，说明煮锅H和A的肉样煮制时间较长，肉中蛋白质的降解程度相对较高[14]。相对于总鲜味氨基酸含量而言，煮锅A、C、D、E、F、G、H和I的鲜味氨基酸含量均不存在显著性差异(P>0.05)，原因可能是老汤经过多年使用，肉中鲜味氨基酸降解与形成速率以及在老汤中的溶解已达到动态平衡[15]，鲜味氨基酸含量的检测可用于评价老汤体系的品质变化规律。

膜修饰传感器通过仪器收集、分析，实现物质含量测定[11]。通过将N，N′-二苯基硫脲膜修饰传感器检测结果与液相色谱检测结果比较，结果的偏离程度<3.66%，说明电化学检测结果虽存在一定偏移，但准确性相对较高，检测结果稳定，数据可靠。且检测的样品前处理方法简单，成本较低，值得工业化生产过程中用于鲜味氨基酸含量检测中推广。

为进一步比较液相色谱检测结果与电化学检测理论值两者之间的差异性和联系，采用双变量相关性分析来研究两者的关系。采用SPSS软件进行Pearson相关性分析，以10锅老汤检测鲜味氨基酸含量的平行检测3次的平均值进行模型构建，绘制Pearson分布散点图，结果如图3所示。

图3 传感器理论值与高效液相色谱仪检测结果的分布图Fig.3 Distribution of theoretical values of sensors and detection results of HPLC

由图3可知，两者的线性拟合度达到0.979，因此可认为传感器所检测的数据与高效液相色谱仪检测的数据是相关的。

2.6 基于鲜味氨基酸的工业老汤稳定性研究

由表3可知，同一煮锅不同取样时间的老汤中鲜味氨基酸含量总体差异不显著(P>0.05)，但存在个别煮锅不同取样批次的鲜味氨基酸存在差异性，就煮锅A而言，批次1和5的检测值与其他取样批次存在显著差异(P<0.05)；煮锅E的鲜味氨基酸含量在不同取样批次间存在差异性：批次1、2和5取样检测结果与批次3、4取样检测结果差异显著；煮锅G、I和J中不同取样批次也存在显著性差异(P<0.05)；其余煮锅不同取样批次的检测结果差异不显著(P>0.05)。差异的原因可能是取样时样品处于不同卤煮阶段，同时原料肉中氨基酸的形成和降解速率的差异，造成肉汤间存在浓度差，导致肉汤间相互渗透[16]；煮制鸡种的差异也会造成检测结果的差异性[18]。酱卤老汤经多年煮制后，其中的滋味物质已达到动态平衡，平衡并不代表各物质含量一成不变，而是在合理的范围内波动，从而达到老汤滋味对产品滋味贡献的稳定性与和谐性。鲜味氨基酸作为老汤中鲜味贡献的重要来源，其含量变化可直接反应老汤品质的变化，检测出的酱卤老汤中鲜味氨基酸含量在一定的范围内波动变化，说明不同煮锅及取样间隔虽存在差异性，但数据波动在合理范围内，可认为老汤品质是稳定的。表4是膜修饰传感器检测结果的测定结果，两者在同一取样条件下检测的数据结果的统计学虽存在差异，但数据差异小，说明膜修饰传感器可较好地替代液相色谱仪进行老汤中鲜味氨基酸含量的检测，利用N，N′-二苯基硫脲膜修饰的传感器检测扒鸡老汤中鲜味氨基酸含量的方法具有可行性，且相较于常规检测方法更为简便易行、快速、节约成本，可以用于实际生产。

表3 鲜味氨基酸含量的高效液相色谱仪检测结果 单位：mmol/L

表4 鲜味氨基酸含量的膜修饰传感器检测结果 单位：mmol/L

2.7 传感器检测的干扰分析

就老汤的标准化而言，高效液相色谱仪实际检测值与传感器模型的拟合度为0.979，接近于1，说明2种检测方法的结果较为接近，但拟合曲线发生了一定漂移；就老汤的稳定性而言，同一取样条件下两者的检测结果接近，因此可以认为传感器检测值与高效液相色谱仪检测的实际值较为接近，但实验结果存在一定误差，原因可能是检测样品差异。实际检测中的工业化老汤尽管经过过滤及离心等一系列前处理，但是其成分相对复杂，其中残留的糖类及短链脂肪酸等小分子能在电极反应过程中影响鲜味敏感物质N，N′-二苯基硫脲与目标氨基酸结合，从而导致信号发生偏移。另一方面，谷氨酸和天冬氨酸在老汤中存在解离程度强弱的问题[19]，且可以结合在寡肽、多肽以及小分子蛋白质，由于蛋白和肽结构复杂且分子内作用力强，在电极反应时目标氨基酸不能准确与N，N′-二苯基硫脲结合从而产生电位变化。同时，N，N′-二苯基硫脲对溶液中鲜味氨基酸的吸附和解离能力也可能会造成影响。

3 结论

通过对不同煮锅、不同批次扒鸡煮制老汤鲜味氨基酸含量进行分析，发现各氨基酸含量变化不受煮锅的影响；不同批次煮锅鲜味氨基酸含量基本不存在显著性差异，说明老汤经过多年煮制后已基本达到标准化与稳定性的要求。将N，N′-二苯基硫脲膜修饰传感器检测的鲜味氨基酸理论值与液相色谱检测结果的实际值进行比较发现，二者检测结果接近，数据较可靠。综合以上分析，可认为应用N，N′-二苯基硫脲膜修饰传感器检测扒鸡老汤中鲜味氨基酸含量的方法准确、可靠，可较好地替代常规方法快速检测老汤鲜味氨基酸含量。