CIP方法清除乳品生产设备中金黄色葡萄球菌生物被膜的研究

王灏然 蒋淼 高印朝

摘 要：金黄色葡萄球菌是一种常见的引起中毒的革兰氏阳性菌。该菌对温度、盐分具有一定的耐受能力，生长范围较广，例如土壤、动物的皮毛和排泄物中。该菌引起食品中毒的肠毒素在食品加工过程中如果无法及时清除很容易导致食品问题。[1]为此，可以采用CIP这种方法去除食品加工设备上的金黄色葡萄球菌生物被膜。本实验旨在探究CIP杀菌方法对金黄色葡萄球菌的杀菌效果。

关键词：金黄色葡萄球菌;金黄色葡萄球菌生物被膜;CIP;乳品生产

金黄色葡萄球菌为球形，直径在0.8μm左右，经显微镜观察呈葡萄串类似的形状。葡萄球菌无芽孢和鞭毛，在个金黄色葡萄球菌培养的过程中，需氧或碱性厌氧条件，最适合的培育环境为37℃，pH应该控制在7.4左右[2]。金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生问题，乳品尤其是原料乳极易受到金黄色葡萄球菌的污染，在中毒之后会导致人體的肠胃壁受神经器刺激，出现恶心、呕吐等中毒反应。[3]

生物被膜（Biofilm，BF）是指细菌在接触物表面分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等多聚物构成胞外基质，将其自身包裹在其中，这是微生物为适应外界环境二=而形成的一种生存策略。在不锈钢、铝等乳品加工设备表面极易形成金黄色葡萄球菌生物被膜。[4]

各种现代化的食品生产技术大量的应用导致食品污染因素更加复杂。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件越来越多，尤其是在乳品生产领域。在此背景下，我们探究一种原位就地清洗方法CIP（Cleaning in palce）清除金黄色葡萄球菌生物被膜的效果，旨在为CIP作为一种新型方法清除乳制品加工管道中的金黄色葡萄球菌生物被膜提供理论依据。[5]

一、材料与方法

1.1菌株、材料与试剂

本实验所用菌种为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 29213）、胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone Soya Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptone Soya Agar，TSA）培养基、PBS溶液、1.5%NaOH溶液、0.5%HNO3溶液、恒温水浴锅。

1.2实验方法

划金黄色葡萄球菌ATCC 29213于TSA培养基，经37°C恒温培养24 h。挑取单菌落于30 mL胰蛋白胨大豆肉汤TSB中，置于37°C恒温摇床（130 rpm）培养8 h。将培养8 h的菌悬液离心（8000 × g，10 min，4°C），用PBS清洗菌体两次，并用PBS重悬浮，稀释菌悬液至OD630 nm = 0.4，此时菌体浓度2×108 CFU/mL。

将菌悬液稀释10倍后，分装于50 mL含不锈钢片（2 cm×5 cm）的离心管中，不锈钢片用于模拟乳制品生产的金属管道，每管30 mL菌悬液，并置于4°C条件下培养24 h，使菌体黏附于不锈钢材料表面。24 h后将不锈钢片在无菌水中漂洗两次，放入装有30 mL TSB的50 mL离心管中，于25°C条件下培养3 d，使金黄色葡萄球菌形成成熟生物被膜。

将成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜用无菌水清洗两次，根据Rangi Priyanka等人报道的方法[6]，在70°C下用30 mL的1.5%NaOH溶液处理5 min，将不锈钢片用无菌水清洗两次，再在60°C下用30 mL的0.5%HNO3溶液处理5 min，将不锈钢片取出，在无菌水中清洗后置于含有30 mL PBS溶液的离心管中涡旋，使不锈钢片上的菌体充分脱落。随后吸取1 mL吹打均匀的菌液梯度稀释，并分别吸取各稀释梯度的样品100 ?L涂布至TSA平板。于37°C培养箱中培养24 h，计算菌落数量。

二、结果

通过CIP清洗的方式，不锈钢片上的生物被膜已完全下降至检出限以下，说明CIP清洁较为有效的杀灭了金黄色葡萄球菌生物被膜中的活菌。

通过清洗液的化学作用、物理作用和在流动过程的机械冲刷作用达到CIP过程中的杀灭细菌生物被膜中的活菌的效果。在碱洗涤中去除蛋白质和碳水化合物，破坏金黄色葡萄球菌生物被膜的胞外基质;在酸洗涤中，可除去设备表面碱性产物，提供抑菌条件，从而抑制任何残留微生物的生长。

我们的研究结果表明，在有机杀菌剂滥用的今天，CIP清洗方案是一种新的食品清洁策略，可将生物被膜的活菌量降至检出限以下，最大限度地减少金黄色葡萄球菌生物被膜污染，从而减小污染、降低成本、缩短清洁时间并提高清洁效率。

参考文献

[1]钟军华.食品中金黄色葡萄球菌检测方法的比较研究[J].现代食品，2019（23）：147-148+152.

[2]赵效南，苑晓萌，张印，胡明，王文博，刘玉庆.山东省生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌的污染状况及耐药性分析[J].山东农业科学，2019，（12）：1-8.

[3]董彬，封丽霞，冯晓，王红坤，李春梅.乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌快速检测的新体系[J].食品安全导刊，2017（34）：72-74.

[4]邢盼盼，邓开野，李南薇.金黄色葡萄球菌生物被膜在食品工业领域的研究进展[J].食品工业，2012，33（12）：150-152.

[5]胡春林.液态食品生产过程微生物控制方法的浅析[J].食品工业，2017，38（07）：245-248.

[6]Rangi Priyanka，Minz P S，Deshmukh Gajanan P，Subramani P，Singh Ripudaman.Application of image analysis technique to determine cleaning of ohmic heating system for milk.[J].Journal of food science and technology，2019，56（12）.

（作者单位：西北农林科技大学）