a-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）对酿酒中双乙酰控制效果研究

李忠英 罗跃中 刘军

摘  要：文章研究了α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）对啤酒双乙酰含量的影响。已知ALDC通过绕过双乙酰生成途径来减少双乙酰。在此，在添加ALDC的条件下酿造啤酒。游离氨基氮（如缬草碱）对双乙酰的生成有相反的影响。在样品中加入0.02，0.04，0.06单位/mL的ALDC，并对所得啤酒的理化性质进行了分析，以确定啤酒的质量。双乙酰含量随酶浓度的增加而降低。样品中的二乙酰基含量分别降低了25%和15%，产品质量大大提高。

关键词：a-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）;酿酒;双乙酰控制效果;研究

中图分类号：O657         文献标志码：A         文章编号：2095-2945（2020）30-0066-02

Abstract： The effect of α-acetolactate decarboxylase （ALDC） on the content of diacetyl in beer was studied. ALDC is known to

reduce diacetyl by bypassing the diacetyl formation pathway. Here， beer is brewed under the condition of adding ALDC. Free amino nitrogen （such as valine） has the opposite effect on the formation of diacetyl. The ALDC of 0.02， 0.04， and 0.06 unit/mL was added to the sample and the physical and chemical properties of the beer were analyzed to determine the quality of the beer. The content of diacetyl decreased with the increase of enzyme concentration. The diacetyl content in the sample was reduced by 25% and 15% respectively， and the product quality was greatly improved.

Keywords： α-acetolactate decarboxylase （ALDC）; wine making; diacetyl control effect; study

引言

双乙酰是一种风味化合物，由微生物代谢而成，存在于葡萄酒、奶酪和啤酒等发酵食品中。然而，啤酒中双乙酰的存在是不可取的，因为它的黄油味道。啤酒中双乙酰的阈值为0.1～0.15μg/mL，采用多种方法对其进行降低或消除。可通过使用不同菌株的投料酵母、控制投料率、在麦汁中添加缬草碱或控制麦芽汁的含量来控制麦汁的含量。

1 调节氨基酸与发酵糖的比例

a-乙酰乳酸被细胞内转化为valine或排泄，并通过非常慢的非酶反应（13）而脱羧为双乙酰。通过双乙酰休息，少量的剩余酵母再吸收虫草中的双乙酰，并通过酵母还原酶将其还原为风味较弱的乙酰丙酮和丁二醇。然而，At-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）是由一株改良的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilisis）生产的酶，不存在于沥青酵母中，它可以绕过双乙酰生成或减少双乙酰生成，直接将α-乙酰乳酸转化为乙酰丙酮。本研究采用ALDC对啤酒中的双乙酰进行还原，并与传统的陈酿啤酒进行了比较。[2]此外，还研究了在酶存在下对啤酒质量的影响。

2 材料和方法

所使用的投球酵母是Hefeweizenale酵母WLP 300。采用传统颗粒型啤酒花，a-酸含量为10%。麦芽自动微麦芽系统被用于格式化（浸泡，发芽和烧制）。在15℃下用湿式浸泡和干式浸泡进行浸泡，重复三次。[3]在16%C下发芽5d，然后拔除根部。在45℃下烧制30min，温度提高5℃/min，最终温度达到65℃，然后迅速提高到80℃（18℃），麦芽用滚筒磨在1mm的间隙。采用糊化法进行糖化。在45℃下，将50克砂砾与200mL蒸馏水混合，在45%C下搅拌30 min，然后将温度提高1℃/min，直至终温达到70℃。加入热蒸馏水（70℃），在相同温度下继续搅拌1h。麦汁在20℃快速冷却，加入蒸馏水调节到450g，麦汁过滤采用滤纸过滤。麦汁用间歇性添加的啤酒花煮熟（占总量的一半，10分钟，1/4，5分钟和1/4，5分钟），然后在冰上快速冷却。初始比重法测定酒精含量和糖化度，添加酵母（约6个对数细胞/mL）和0.02，0.04，0.06单位/mL ALDC，在20%C下进行初级发酵4天。将啤酒转瓶后，在15%C条件下进行二次发酵7天，以酶产生量1mmol/min确定为ALDC活性单位。使用比重计测定了比重。在初级发酵结束和二次发酵结束时，比较了样品的比重和对照值的变化。分析酵母活力，活细胞（对数细胞/mL）还原亚甲基蓝。[4]

为了变白，使用血细胞计（Marienfeld-Superior，Lauda-K nigshofen，德国）。第一次发酵和二次发酵分别进行4天和7天的Viablecell计数，并与未用酶处理的对照样品进行比较。用比色仪测定了啤酒发酵全过程中颜色的变化（CR-300;日本大阪美能达有限公司）。测定亨特L（光度）、a（红度）和b（黄度），并与对照样品进行比较。

用AOAC（官方分析化学家协会）方法分析游离氮

（FAN）的变化。为显色，将1mL显色试剂与样品混合，在水浴中加热16min，冷却至20=1C。加入5mL碘酸钾稀释液，在570nm处测定吸光度。该程序重复了3次，计算了的含量如下：（mg/L）=试验溶液的净吸光度值x2x稀释/标准溶液的凈吸光度值。

用测压仪（211-DK-12;Dackwang）测定了酒精性啤酒的酒精含量，并用食品标准法中的方法计算。将最终醇含量与对照样品进行比较。[5]

用ASBC法测定苦味度。将10mL 20'C脱碳啤酒转移到离心管中，加入0.5mL 6NHCl和20mL异辛烷。密封摇管（250rpm，15min），离心（1036×3min）。在275nm处测得含有异辛烷的上清液，并测定了溶液的吸光度。苦味计算如下：

苦味=50×Absorbance值，用紫外分光光度计测定啤酒的浊度，如果700nm的吸光度值是430nm的0.039倍，则将啤酒视为“混浊”;否则，将啤酒视为“不混浊”。用ASBC法测定了啤酒的泡沫稳定性。将50mL的样品放入泡沫漏斗中，放置230s，对泡沫（B）和剩余泡沫（C）的体积进行分析。

双乙酰标准曲线泡沫稳定性计算如下：

E=230/2.303 log（b+c）cj

其中E是泡沫稳定性。

用ASBC法分析双乙酰含量。将100mL啤酒蒸馏，制得50mL的去二苯乙烯，再加入5mL的去二苯乙烯水。将5mL ALI转至A10mL容量瓶中，加入1mlα-萘酚溶液进行旋转。加入0.5mL的KOH-肌酸溶液后，摇匀1min，室温下放置5min，在530nm处测定吸光度。根据标准曲线计算吸收值。采用方差分析（ANOVA）和统计分析软件SPSS，对平均值的差异进行统計学分析，采用Duncan的多重比较检验方法进一步分析样本间的显著性差异。[6]

3 结果和讨论

麦汁的比重稳定下降，说明酒精的产生，两种啤酒的比重相似，对照的比重为1.039，酶处理样品的比重分别为1.038、1.038和1.039。大香对照为1.040，酶处理样品分别为1.041、1.041和1.038。经二次发酵后，最终比重均为1.008，但添加10ppm的样品除外。该样品的值略低于其它样品。但差异无显著性（P>0.05）。

对照样品和酶处理样品的比重与报道值基本一致。因此，酶的添加对酒精发酵没有负面影响。

酵母活力在发酵过程中的生理和活性，对于获得高质量的啤酒是非常重要的。酵母活力的结果，确定啤酒酵母的最佳投递率为5×106细胞/mL。对照样品在初级发酵过程中，酵母的生长增加了2.02个对数细胞/mL，与酶处理样品的生长结果一致。在二次发酵过程中，酵母的生长分别增加了2.08和1.79log/mL。同样，酶处理样品也显示了相似的结果。不同品种中酵母生长的差异似乎受酵母生长所需的蛋白质和碳水化合物含量的影响。[7]

苦味是啤酒的关键品质参数，由啤酒花的茶酸决定。它们在麦汁煮沸过程中被异构化，并传递啤酒的重要风味化合物。标准苦味范围为10～40BU（苦味单位），所有样品的比值均在此标准范围内。

酵母与蛋白质-多酚相互作用导致混浊，这可以是参数提供效率。所有的样品都显示出浑浊，因此证实了发酵所处的位置。啤酒的泡沫稳定性依赖于许多组分的相互作用，如啤酒花等酸、蛋白质、金属离子和气体组成。

麦汁中的缬草碱缺乏会导致双乙酰水平升高。由于酵母在谷氨酰胺存在时会使其它氮源代谢，因此氨基酸如丙戊酸被认为是重要的氨基酸。因为氨基酸会影响双乙酰含量，所以它们的含量是很重要的。

经ALDC处理后，双乙酰含量下降。啤酒A双乙酰含量由5.17降至131ppm，啤酒B含量由9.75降至1.54ppm。结果表明，与对照相比，双乙酰含量分别降低了25%和15%。商品啤酒的双乙酰水平为0.33mg/L，而微型啤酒厂和酿酒厂的平均双乙酰水平超过1.0mg/L（39）。由于啤酒都是微调酿造的，所以双乙酰含量是相当高的。

4 结束语

总之，ALDC处理明显降低了啤酒发酵产生的双乙酰含量，在不影响啤酒质量的前提下缩短了发酵时间。另外，酶对降低双乙酰含量有明显效果，酶的加入对规模化啤酒发酵也具有很大的潜力。

参考文献：

[1]刘会灵，刘栓英，潘龙泽，等.转录调控因子ALsR表达强度对枯草芽孢杆菌合成乙偶姻和2，3-丁二醇的影响[J].应用与环境生物学报，2020，26（04）：753-759.

[2]刘文娟，黄守锋，葛菁萍.枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因（alsD）的克隆和生物信息学分析[J].中国农学通报，2019，35（21）：96-102.

[3]赵晨晓.甲基转移酶、精氨酸脱氨酶及乙酰乳酸脱羧酶的催化机理研究[D].山东大学，2017.

[4]王长丽，孙雯，黄守锋，等.产酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）α-乙酰乳酸脱羧酶基因（BudA）的克隆及生物信息学分析[J].黑龙江大学自然科学学报，2016，33（06）：795-801.

[5]王春.磁性纳米微球的制备以及其应用在α-乙酰乳酸脱羧酶的固定[D].大连工业大学，2015.

[6]李浩.固相萃取-高效液相色谱法测定α-乙酰乳酸脱羧酶中四环素残留量[J].食品与发酵科技，2015，51（01）：91-95.

[7]王利.α-乙酰乳酸脱羧酶基因过表达和敲除的K.pneumoniae代谢特性分析[D].大连理工大学，2012.