外泌体源性miRNA在胃癌中的研究进展

冀春鹏，汪宝林

(南京医科大学第二附属医院普外科，南京 210011)

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。近年来胃癌整体发病率呈上升趋势，5年生存率较前明显提升[1]。据统计，2015年我国胃癌发病率位居恶性肿瘤第二位，仅次于肺癌，新发病例约40.3万[2]。胃癌传统的治疗手段包括手术、化疗以及放疗，由于我国胃癌早期检出率较低，多数患者就诊时已处于中晚期，传统手段治疗的胃癌5年生存率仍偏低[2-3]。因此，深入研究胃癌的发生发展机制，寻找更加有效的胃癌早期诊断标志物以及潜在的分子作用靶点，对于降低胃癌患者死亡率以及改善生存预后具有重要的临床意义。

研究发现，胃癌患者血液中外泌体较正常人高近1倍，其中不同肿瘤组织和细胞来源外泌体中所包含的生物活性物质[信使RNA、蛋白质、微RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA、环状RNA等]可以通过递送至特异性细胞，进而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[4-5]。miRNA是一种小分子非编码RNA，广泛参与胃癌的发生发展，miRNA可以通过直接或间接调控靶蛋白的表达影响肿瘤细胞的生长、增殖、转移等生物学过程。有研究证实，外泌体源性miRNA具有较好的稳定性，可能成为一种新的肿瘤标志物[6-7]。因此，外泌体源性miRNA有望成为胃癌早期诊断的检测靶标，为胃癌患者开拓新的治疗策略。现就外泌体源性miRNA在胃癌中的生物学作用进行综述。

1 外泌体概述

1.1外泌体的生物学特性 外泌体来源于细胞内多囊泡体，经过多囊泡体与细胞膜融合后，释放至细胞外基质，是一种直径为40～100 nm的膜性囊泡网。其表面存在特异性的标志物，如CD63、CD9、肿瘤易感基因101蛋白等，通过特异性检测相关标志物有助于外泌体的提取与分离[7-8]。外泌体的释放是一种多级别的生物学过程。首先形成多囊泡小体，之后借助热激蛋白90、Rab家族蛋白等相关驱动分子促使多囊泡小体与细胞膜融合，并将其释放至细胞外。其中，Rab27b主要通过调节多囊泡小体向细胞质膜转运，Rab27a主要负责多囊泡小体与细胞质膜融合过程中气道细胞骨架的重新排列。另外，外泌体的释放与溶酶体也存在一定的关联，特异性蛋白质的泛素化修饰可促进多囊泡小体与溶酶体融合，进而减少外泌体的释放。因此，调控外泌体的合成与释放对细胞间信息传递具有重要意义。研究发现，外泌体中含有多种生物活性物质，包括蛋白质、核酸及脂质等，可由多种不同类型的细胞释放，在血液、尿液、脑脊液等多种体液中均有分布。外泌体可介导细胞间物质和信息传递，参与抗原呈递、免疫应答、蛋白质和RNA的转运等生理和病理过程[9-11]。来源于不同细胞的外泌体含有源细胞关键的功能分子，其中肿瘤细胞来源的外泌体是目前研究的热点，外泌体可通过调控细胞间信号转导，促进血管新生等细胞生物学行为，影响肿瘤细胞代谢状态、侵袭增殖能力等[12]。因此，研究外泌体源性物质与肿瘤的生长、复发和转移至关重要。

1.2外泌体源性miRNA 外泌体内含多种RNA，包括信使RNA、长链非编RNA和环状RNA等。其中成熟性miRNA的表达含量最高，约占41.72%[13]。miRNA是一类长为20～24 nt的内源性非编码小RNA，它可通过与靶基因3′非翻译区结合，降解靶基因信使RNA或抑制其翻译，从而降低靶基因的表达水平，参与调控多种基因表达[14]。研究发现，胃癌组织可高表达miR-21、miR-221和miR-421等[15-17]。而外泌体膜脂质分子可以抑制RNA酶活性，从而保证外泌体源性miRNA能够长时间存在于血液、尿液、脑脊液中。现已发现外泌体源性有高达2 838种特异性miRNA[18]。不同细胞来源的外泌体会包裹其特异性miRNA等生物活性物质。胃癌细胞源性外泌体、肿瘤微环境源性外泌体以及血浆循环外泌体均可以包裹特定的miRNA，通过与细胞受体结合，细胞质膜融合最终将miRNA递送至肿瘤组织细胞中，进而参与调控肿瘤细胞的生长、增殖和侵袭等过程[19-20]。

2 外泌体源性miRNA在胃癌发病中的作用机制

2.1调控胃癌的生长、转移和侵袭 外泌体源性miRNA主要包括肿瘤细胞来源外泌体miRNA、肿瘤微环境来源外泌体miRNA以及循环性血浆来源外泌体miRNA。体外细胞检测显示，与正常细胞相比，肿瘤细胞会分泌更多的外泌体[21]。胃癌细胞在生长过程中释放外泌体作用于自身细胞或其他相关癌细胞，其中外泌体内含miRNA可通过释放进入胃癌细胞，参与调控肿瘤细胞的增殖以及转移。在胃癌细胞株(AZ-P7a)中检测到大量的胃癌细胞源性外泌体，其中外泌体可以通过将宿主细胞的let-7 miRNA外排进而促进胃癌细胞的增殖和转移[22]；另有研究通过提取胃癌细胞株(SGC-7091)外泌体并将其与肿瘤相关成纤维细胞共孵育发现，SGC-7091源性外泌体可诱导肿瘤相关成纤维细胞表型转化。通过miRNA基因芯片分析显示，SGC-709源性外泌体中miRNA可能通过调控转化生长因子-β参与肿瘤细胞的黏附、侵袭转移过程[23]。通过提取食管癌细胞中外泌体miRNA发现，miR-25和miR-210表达显著增加，其与胃癌细胞共孵育可诱导肿瘤细胞的生长和转移，导致肿瘤细胞的表型转化[24]。

肿瘤微环境是指肿瘤细胞所在的外部环境，是肿瘤生长和增殖的基石。有研究发现，肿瘤微环境来源外泌体miRNA可参与调控胃癌的生长与复发[25]。骨髓间充质干细胞作为肿瘤微环境的组成成员，可通过分泌外泌体作用于肿瘤细胞，参与多种肿瘤细胞的病理生理过程。韩伟等[26]研究显示，骨髓间充质干细胞分泌外泌体源性miR-221能够转移到胃癌细胞(HGC-27)，促进HGC-27细胞的增殖与转移。

循环性血浆来源外泌体在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。既往研究证实，外周血中外泌体源性miRNA的异常表达与胃癌密切相关[27]。外泌体是一种膜性囊泡小体可以保护miRNA被降解。因此，外周血循环miRNA可能成为胃癌的新型标志物。在胃癌患者的血清中发现外泌体源性miR-451、miR-1和miR-221的表达异常增高，进一步研究发现外泌体源性miR-451和miR-221的差异表达水平与胃癌恶性程度呈正相关[28]。另有研究发现，胃癌患者血浆外泌体源性miR-423表达水平显著升高，诊断效能显著优于依靠肿瘤标志物的检测；且外泌体源性miR-423表达水平与肿瘤的转移程度呈正相关[29]。综上可知，循环性外泌体源性miRNA差异性表达可能成为胃癌早期临床诊断的标准。

2.2调控胃癌的免疫微环境 肿瘤免疫微环境的失衡是造成肿瘤异常增殖和生长的重要因素。初期，机体的免疫系统会对肿瘤实行免疫监测，清除相应的免疫源性癌细胞。中期，具有弱免疫源性的肿瘤细胞因为逃脱监测存活下来，致使机体与肿瘤细胞达到一种免疫平衡状态。后期，由于肿瘤细胞的异常过度增殖以及累积，促使免疫平衡被打破，从而导致肿瘤细胞进入免疫逃逸阶段，诱发机体产生恶性病变[30]。因此，通过调控肿瘤细胞的免疫微环境，改善肿瘤微环境对肿瘤的治疗至关重要。研究发现，外泌体源性miRNA可以调节免疫微环境(辅助性T细胞17等)进而影响肿瘤的发展过程[31-32]。在胃癌细胞株(MKN-451)中，MKN-451可分泌外泌体源性miR-451，活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路促进T细胞分化为辅助性T细胞17，诱发机体的炎症反应，最终导致肿瘤进展加快。可见，外泌体源性miRNA可作为T细胞的诱导剂，参与胃癌的生长与转移[33]。

2.3调控胃癌的耐药作用 外泌体能够诱导化疗药物的抵抗性，铂类药物是胃癌患者常用的基础化疗药物。在长期的药物化疗过程中，胃癌患者会因此出现肿瘤耐药现象，导致化疗失败[34]。既往研究发现，外泌体在肿瘤细胞耐药中发挥重要作用，可能通过阻止药物与抗体的相互作用，最终导致耐药的形成[35]。间充质干细胞的外泌体能够通过激活胞外信号调节激酶信号通路诱导胃癌细胞的抗药性。Sousa等[36]研究发现，耐药性肿瘤细胞分泌外泌体能够降低肿瘤细胞对药物的敏感性，其机制可能为通过外排药物和递送miRNA，提示外泌体源性miRNA可能是肿瘤耐药的重要机制。在胶质母瘤细胞中，外泌体源性miR-221可以靶向抑制发动蛋白3诱导肿瘤细胞替莫唑胺耐药的形成。与正常对照细胞相比，M2巨噬细胞分泌外泌体源性miR-21显著增加。其外泌体源性miR-21与胃癌细胞共培养，结果显示miR-21通过靶向抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因，诱导磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B活化，从而导致胃癌细胞对顺铂的耐药性[37]。此外，M2巨噬细胞外泌体也可以通过促进Bcl-2表达抑制胃癌细胞放化疗时的细胞凋亡[38]。以上研究表明，外泌体能够通过递送miRNA作用于胃癌细胞，导致胃癌细胞的耐药性，促进胃癌的发生发展。

3 外泌体源性miRNA在胃癌诊断中的作用

外泌体包含的相关生物活性物质(核酸、蛋白质等)可以反映源细胞的类型以及生存状态[39]。因此，通过检测循环中的肿瘤外泌体有助于胃癌早期诊断和液体活检[40]。通过检测肿瘤外泌体可能对胃癌的发生发展做出快速、灵敏的诊断。通过检测恶性肿瘤腹水中循环外泌体miRNA表达谱发现，miR-21表达显著增加[41]。其中外泌体源性miR-1225-5p、miR-320c、miR-1202、miR-4270、miR-1207-5p在胃癌患者腹腔灌洗液和胃癌细胞中均高表达，提示可能与胃癌转移和扩散相关。miR-1225-5p和miR-21的高差异性表达，提示其在胃癌复发和转移中可能成为有效的生物标志物[41-42]。另有研究对胃癌患者和健康受试者的血浆外泌体miRNA进行表达谱差异性分析，结果显示，与健康受试者相比，胃癌患者血浆外泌体源性miR-452-5p的表达显著增加，随后对68对样本进行验证，miR-452-5p的表达同样显著增加[43]。许镇等[44]收集了40例胃癌患者和20例健康受试者的血清标本，分离提取得到血浆外泌体并对外泌体源性miR-27a进行测定，结果显示胃癌患者血清miR-27a的表达显著降低，且与胃癌的分级呈负相关。因此，临床早期筛查miR-27a可能成为胃癌诊断的重要手段。以上研究提示，血浆外泌体源性miRNA可能成为胃癌患者新的潜在生物标志物。外泌体源性miRNA对胃癌细胞的调控作用总结，见表1。

表1 外泌体源性miRNA对胃癌细胞的调控作用

4 外泌体源性miRNA在胃癌治疗中的作用

外泌体具有体积小、分布均匀等特点，适合作为纳米级别药物载体，在胃癌的治疗中发挥重要作用。外泌体对胃癌的发生、发展有重要影响，外泌体源性miRNA可以通过干预胃癌细胞的代谢过程，最终

miRNA:微RNA；Th17：辅助性T细胞17；DNM3:发动蛋白3；PTEN：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因；PI3K/Akt：磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B达到治疗胃癌的目的。既往研究发现，转染miR-21抑制剂可以抑制巨噬细胞外泌体对胃癌细胞(BGC-823)的作用，促进癌细胞的凋亡，抑制细胞迁移[45]。以上研究表明，外泌体可能成为一种药物的载体通过递送相应的生物活性物质进入胃癌细胞，进而影响胃癌细胞的生长、复发。同样，使用高剂量质子泵抑制剂能够通过抑制胃癌细胞外泌体分泌，减少外泌体内含miRNA的表达，抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，增强抗肿瘤药物的活性[46-47]。在斑马鱼动物模型中，外泌体亦能搭载抗肿瘤药物并通过血液循环到达肿瘤特定部位，从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖[48]。因此，胃癌细胞源性外泌体可能成为一种新型的“转运载体”并通过搭载抗癌药物或miRNA治疗胃癌[49]。在今后的胃癌诊治中，可以通过靶向调控外泌体源性miRNA，进而为胃癌的防治提供新手段。

5 小 结

外泌体中富含众多的生物活性物质，在胃癌的发生发展中发挥重要作用。其中外泌体源性miRNA参与调控胃癌的生长、转移、侵袭、免疫微环境、耐药性形成以及治疗等，但其具体的分子生物学作用机制尚不清楚。目前有关外泌体源性miRNA的研究主要集中于细胞水平，有关血浆外泌体源性miRNA与胃癌患者关系和机制的研究较少。因此，未来深入探究血浆外泌体miRNA与胃癌的关系，可能能为胃癌的临床诊断和治疗提供新方法。