3，5-二硝基水杨酸比色法测定大米中水溶性糖含量

王莉丽 梅文泉 陈兴连 方海仙 刘兴勇 杨东顺 王卫清

(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所；农业农村部农产品质量监督检验测试中心，昆明 650223)

食品中含有多种糖类，包括具有还原性的葡萄糖、果糖、麦芽糖，也有不具有还原性的蔗糖[1]。大米是一种食品，在人类的饮食结构中占有举足轻重的地位。以前对大米中淀粉和蛋白质测定研究较多[2-4]。在大米品种育种和质量检验中，有时要求测定其还原糖与蔗糖的总量，即水溶性糖含量。建立大米中水溶性糖含量的测定方法，对于鉴定大米品种、评价大米品质、保障大米质量具有重要意义。一般水溶性糖的测定方法有滴定法[5,6]，3，5-二硝基水杨酸比色法[7,8]、蒽酮比色法[9,10]、苯酚-硫酸比色法[11]、高效液相色谱法[12]等。本文在参考以上有关文献的基础上，建立了采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定大米中水溶性糖含量的方法。方法测量范围宽、准确度和灵敏度高，重现性好，操作简单、快速，具有参考价值。有关采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定大米中水溶性糖的方法鲜有文献报道。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

20%乙酸锌溶液：称取100 g乙酸锌(分析纯)，加15 mL冰乙酸(分析纯)，加蒸馏水溶解并稀释至500 mL。

10%亚铁氢化钾溶液：称取50.0 g亚铁氢化钾(分析纯)，加蒸馏水溶解并稀释至500 mL。

6.0 mol/L盐酸溶液：取250 mL蒸馏水，置于500容量瓶中，缓慢加入250 mL盐酸(优级纯)。

6.0 mol/L 氢氧化钠溶液：称120 g氢氧化钠(分析纯)，置于100 mL 烧杯中，用约70 mL蒸馏水溶解后转移到500 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。

葡萄糖标准溶液：葡萄糖(分析纯)于105 ℃烘箱中烘至恒重，取出放入干燥器中冷却后称0.500 0 g，置于500 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即配成浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

3,5-二硝基水杨酸溶液: 3.25 g 3,5-二硝基水杨酸(分析纯)溶于少量水中，移入500 mL容量瓶中，加2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇(分析纯)，摇匀，定容。

甲基红指示剂：称取0.1 g甲基红(分析纯)溶于50 mL 95%乙醇(分析纯)。

1.1.2 仪器

HR2839型组织捣碎机，BSA224S-CW型电子分析天平，ELGA CENTRA R200型纯水系统，SHA-CA型水浴恒温振荡器，specord210plus型紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

提取：大米样品在组织捣碎机中捣碎，过60目筛。称取大米样品8.00 g，置100 mL容量瓶中，加水至70 mL左右，60 ℃水浴中提取0.5 h，其间每过10 min摇动1次。取出立即先加入5 mL乙酸锌溶液，摇匀后再加入5 mL亚铁氢化钾溶液，摇匀冷却后定容，过滤，滤液备用。

水解[13]：准确移取滤液50 mL，置于100 mL容量瓶中，加入5 mL浓度为6.0 mL盐酸，70 ℃水浴中水解15 min，取出冷却后，加2滴甲基红指示剂，用6.0 mol/L氢氧化钠溶液中和水解液至红色消失，用水定容，摇匀后用于比色。

比色：准确吸取水解液1.0 mL于10 mL比色管中，加入3，5-二硝基水杨酸试剂1.0 mL，混合均匀后沸水中加热6 min，取出迅速用流水冷却，加水定容至10 mL；在1.0 mL去离子水中加入1.0 mL 3，5-二硝基水杨酸作相同加热处理后用于分光光度计的调零。540 nm处测定样品的吸光度值，根据标准曲线，计算大米中水溶性糖的含量。

1.2.2 绘制标准曲线

用移液管准确吸取0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL葡萄糖标准溶液分别置于10 mL试管中，用蒸馏水补充至1.0 mL，加3,5-二硝基水杨酸溶液1.0 mL，摇匀后按1.2.1比色。以葡萄糖标准溶液中葡萄糖含量(mg)作横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。同时做试剂空白。

1.2.3 计算公式

大米中水溶性糖含量按公式(1)计算。

(1)

式中：ω为大米中水溶性糖含量/%；m1为大米称样量/g；m2为样品溶液吸光度值减去试剂空白的吸光度值后从标准曲线中查得的水溶性糖含量/mg；V1为提取体积/mL；V2为分取体积/mL；V3为最后定容体积/mL；V4为用于比色的样液体积/mL；100为换算为百分含量的系数；1 000为将g换算为mg的系数。

本实验条件下，m1为8.00 g，V1为100 mL，V2为50.0 mL，V3为100 mL，V4为1.0 mL。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

实验中加入的3，5-二硝基水杨酸与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物3-氨基-5硝基水杨酸[14]。在一定波长范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比。3，5-二硝基水杨酸法测定波长有490、520、540、580 nm等[15-18]，其最佳波长的确定受到仪器性能、灵敏度、实验样品和3，5-二硝基水杨酸显色剂等因素的影响[19]。为了确定测定大米中水溶性糖的最佳波长，在450～600 nm波长范围内对3，5-二硝基水杨酸和葡萄糖经显色后进行扫描，结果如图1所示。

图1 3，5-二硝基水杨酸和葡萄糖扫描曲线

由图1可知，葡萄糖扫描曲线最大吸收波长为500 nm。为了提高检测灵敏度，通常选取最大吸收峰处的波长进行测定。但从3，5-二硝基水杨酸溶液扫描曲线可以看出，在500 nm波长下，3，5-二硝基水杨酸具有约0.5的吸光度值，会对测定葡萄糖产生较大干扰。当波长为540 nm时，干扰最小。因此将540 nm作为检测波长。

2.2 提取和显色条件实验

2.2.1 样品称样量

对同一样品分别称取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g样品，然后按1.2测定水溶性糖含量，结果见图2。由图2可以看出，测定结果与称样量有较大的关系，当称样量为8.00 g时，测定结果最大，因此本实验选取称样量为8.00 g。

图2 不同称样量的大米水溶性糖含量

2.2.2 样品粉碎粒度

同一份大米样品在组织捣碎机中捣碎，分别过20、40、60、80、100目筛，然后按1.2.1测定不同粉碎粒度的大米吸光度值，结果见图3。由图3可知，过60目筛样品吸光度最大，继续增大目数吸光度值不再增加。因此本研究实验中将粉碎后过60目筛的大米样品用于测定。

2.2.3 提取温度

选择50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0 ℃不同提取温度提取后测定同一样品的吸光度，结果见图3。由图3可知，提取温度较低时，大米中可溶性糖的提取率较低。提取温度过高，提取率也较低。淀粉作为大米中的主成分，其含量占大米干基的90%以上[20]，提取温度升高后，大米中淀粉糊化,其淀粉颗粒在水中受热吸水膨胀，使样液的黏度增大[21]，影响提取液的制备。当温度为60.0 ℃时，样液提取效果最佳。因此本研究实验选择60.0 ℃作为提取温度。

图3 提取和显色条件实验结果

2.2.4 乙酸锌溶液和亚铁氢化钾溶液加入量

结果表明加入乙酸锌溶液和亚铁氢化钾溶液各5.0 mL时，大米中蛋白质的沉淀效果较好，得到的样品溶液透明澄清，故本实验选择加入各5.0 mL的乙酸锌溶液和亚铁氢化钾溶液。

2.2.5 3，5-二硝基水杨酸加入量

选择0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.2和1.4 mL不同加入量测定同一样品的吸光度，结果见图3。由图3可知，当加入量为1.0 mL时，吸光度最大，继续增加3，5-二硝基水杨酸用量吸光度不再增加，因此，本研究实验选择3，5-二硝基水杨酸加入量为1.0 mL。

2.2.6 煮沸反应时间

选择煮沸反应时间1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 min进行实验，结果见图3。由图3可知，煮沸加热时间需大于5 min，3，5-二硝基水杨酸才能与样液中的可溶性糖完全反应，并得到稳定的橘红色比色液。因此，本研究实验选择煮沸加热时间6 min。

2.2.7 样液稳定时间

对煮沸后样液的稳定性做实验对比，选择放置0.17、0.5、1.0、4.0、10、15 h和20 h测定同一样品的吸光度，结果图3。由图3可知，可溶性糖与显色剂反应生成的橘红色溶液在4 h内保持稳定。故应在显色反应后4 h内进行测定。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线

按1.2.2测定不同浓度葡萄糖对应的吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图4。

图4 葡萄糖标准曲线

图4的标准曲线表明，在测定范围内的葡萄糖含量与其对应的吸光度值之间呈良好的线性关系，回归方程Y=0.968 2X+0.014 4，相关系数R2=0.999 6。

2.3.2 准确度和精密度测定

品种为清馥臻稻的大米样品捣碎后过60目筛，称取12份，每份8.00 g，分为4个组，每组3份。第一组按1.2测定水溶性糖含量，取平均值作为本底值；第二组加入葡萄糖10 mg，即添加质量分数为0.10%；第三组加入葡萄糖50.0 mg，添加质量分数为0.50%；第四组加入葡萄糖200 mg，添加质量分数为2.0%。即添加低、中、高3个浓度。按1.2测定水溶性糖含量，计算回收率和相对标准偏差，结果见表1。

由表1可知，添加0.10%、0.50%和2.0%的加标回收率平均值为91.9%～98.3%，相对标准偏差为2.68%～2.79%，说明该方法用于测定大米中水溶性糖具有较高的准确度和精密度。

表1 回收率和相对标准偏差测定结果

2.3.3 方法检出限的测定

参考文献[22]分光光度法测定方法检出限：按照样品分析的全部步骤，重复10次空白实验，计算方法检出限，结果为0.003%。

2.4 实际样品测定

应用所建立的方法，对采自云南各地的10份大米中的水溶性糖含量进行了测定。10份大米名称、产地和测定结果见表2。

表2 大米水溶性糖含量测定结果

测定结果10份大米水溶性糖质量分数为0.12%～1.95%。10份大米中有籼米6份，粳米2份，糯米2份。6份籼米的水溶性糖质量分数为0.12%～0.61%；2份粳米的分别为0.45%和1.11%；2份糯米的分别为0.74%和1.95%。

10份大米中水溶性糖含量最低为0.12%。按2.3.3测定本文方法检出限为0.003%，建立的方法完全满足测定大米中水溶性糖时对灵敏度的要求。

3 结论

本实验建立了3，5二硝基水杨酸比色法测定大米中水溶性糖含量的方法。在优化的提取和显色条件下，高、中、低3个添加浓度的加标回收率为91.9%～98.3%，相对标准偏差为2.68%～2.79%，检出限为0.003%。方法测定范围宽、准确度和灵敏度高，重现性好，操作简单、快速，主要试剂3,5二硝基水杨酸在一般试剂商店就能买到,比较容易推广。对6份籼米、2份粳米和2份糯米共10份大米中的水溶性糖含量进行了测定，测定结果10份大米中水溶性糖质量分数为0.12%～1.95%。