沉默SOCS1基因表达对人口腔癌KB细胞增殖的机制研究*

张树鹰，冯 瑶

1.锦州医科大学附属第二医院口腔惠民综合门诊(锦州 121000)；2.佳木斯大学附属口腔医院牙体牙髓一科(佳木斯154004)

口腔癌为临床常见恶性肿瘤，我国口腔癌发病率约为全身恶性肿瘤的1.5%～5.6%，目前临床依然缺乏行之有效治疗手段，研究表明对于肿瘤患者癌灶恶化程度越大其复发及转移风险越高[1]。肿瘤恶化与机体内细胞异常凋亡或增殖密切相关，近期有研究表明恶性肿瘤属于多基因、多途径、多因素的过程，发病与多种基因异常表达有关，而进一步探究影响口腔癌恶性行为的关键基因，或可为口腔癌早期诊治提供参考[2]。细胞因子信号转导抑制因子1(Suppressor of cytokine signal transduction 1，SOCS1)在肿瘤恶性生物学行为中发挥关键作用，SOCS1高表达不仅会阻碍癌细胞转移且会抑制癌细胞侵袭[3]，研究表明，沉默SOCS1表达可抑制肿瘤细胞增殖，并阻止恶性转化[4]；小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)作为目前临床常用基因沉默技术，目前已广泛应用于肿瘤相关功能研究中。但目前关于siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞增殖、凋亡及侵袭影响的研究尚处于初步探索阶段，为此本文展开临床研究，结果报告如下。

材料与方法

1 实验试剂和材料 ①人口腔癌KB细胞株，兔抗人SOCS1多克隆抗体(H93)以及兔抗人β-actin多克隆抗体，人口腔癌细胞株(中国典型培养物保藏中心)，10%胎牛血清(杭州四季清生物工程材料研究所)、RNA提取试剂盒和PCR扩增试剂[宝日医生物技术(北京)有限公司]、细胞培养箱(Thermo)(371型，美国FORMA)、细胞基质胶(BD公司)、RT-PCR试剂盒、核酸内切酶(NEB)、SOCSl抗体(Sigma)、13-actin抗体(武汉，博士德)、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(南京，碧云天)、细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、预染蛋白Marker(美国，Thermo Fisher Scientific)、引物(上海生工公司)、流式细胞仪(美国，BD)，梯度PCR仪(美国，Applied Biosys.tems 9700)。②人口腔癌KB细胞入组标准：规格齐全，质量可靠，均冻存于本院生化药理研究室内。

2 实验方法

2.1 KB细胞培养：细胞冻存管放置在37 ℃水浴锅中以融化，细胞液溶解后离心5 min，吸弃上清液，冻存管内加入洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640培养基中，悬液吸至细胞培养瓶中，加3 ml完全培养箱中(5%CO2、95%饱和湿度，37 ℃)培养，次日对细胞贴壁状态进行观察并更换新鲜培养基继续培养。细胞生长至覆盖瓶底约85%时开始传代，擦拭台面(酒精)，将旧培养液吸弃，加 PBS 洗涤2遍细胞。0.25%胰蛋白酶溶液进行消化，细胞逐渐变圆、细胞间隙增大时，加入RPMI-1640完全培养液中，同时停止消化。细胞悬液转移至离心管内，常规离心。弃上清液，加新鲜 RPMI-1640完全培养液并继续培养。选生长状态良好且处于对数期的细胞冻存。

2.2 细胞免疫化学检测：KB细胞溶解后，滴至小玻片处，并置于培养箱中(37 ℃、5%CO2、培养3 d)，采用PBS洗涤2次-甲醛固定-PBS清洗-甲醛双氧水室温浸润-蒸馏水清洗-滴加封闭液以及一抗(对照组以PBS液代替)、PBS清洗后滴加聚合HRP标记抗兔IgG、37 ℃孵育30 min、PBS清洗、DAB显色、苏木素复染、封片，镜下观察；结果判断：高倍镜下细胞膜/细胞质呈棕黄色为阳性。SOCS1基因mRNA序列设计：有效siRNA序列：sense 5’-GACUGAUUCCUAUUAAAUA-3’，anti sense 5’-UAUUUAAU AGG AAUC AGUC-3’，人类基因外显子不存在同源性。阴性对照siRNA序列：sense 5’-ATTGTTTAGTTTTGTGTTAGGAGTTTT-3’，anti sense 5’-ACCAACAACTACCTACTCCCTAAAC-3’。

2.3 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞增殖设计：四唑盐比色试验进行检测，采集空白对照组、阴性组、转染组KB细胞，细胞密度1×104/孔，培养板上行细胞接种，每次设置5个复孔，细胞干预24、48、72、96 h，培养板上加入20 μl/孔四唑盐，37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养4 h。丢弃上清液，每孔加150 μl二甲基亚砜，室温振荡10 min，检测每孔(波长=490 nm)的吸光值，细胞增殖率=样本组OD值与空白对照组OD值的比值。

2.4 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞凋亡的检测：流式细胞仪检测，KB细胞指数期增长时，胰蛋白酶进行消化，细胞密度=4.0×105个/孔，在六个孔板中进行接种并培养24 h，而后加吉西他滨，继续培养24 h，上清培养基移至离心管中，PBS清洗1遍后，胰蛋白酶消化后，将细胞悬浮液吸出，吸至离心管内，离心5 min后将上清液丢弃，应用PBS清洗后再次离心，将上清液丢弃，加入300 μl PBS进行重悬，细胞转染后两天内收集各组的细胞，PBS清洗3次后，流式细胞仪检测细胞周期。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数。

2.5 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞侵袭的检测：Materigel胶与预冷无血清MEM培养基，按1∶8比例稀释，每孔50 μl均匀包被在Transwell小室底部膜内表面，培养箱中放置使成胶，确保细胞沿低营养室往高营养室进入，取对数生长期KB细胞，经消化离心后，培养基中进行重悬计数，每个内室加200 μl细胞悬液，每孔加5.0×105个细胞。24孔板外室加700 μl含5%胎牛血清培养基，共培养24 h，将上清液及细胞等去除，PBS清洗1次，甲醛固定后应用PBS清洗后进行染色、水洗同时风干、封片，镜下观察，相对侵袭指数=(转染细胞穿膜数/未转染细胞穿膜数)×100%。

结 果

1 人口腔癌KB细胞中SOCS1表达情况 SOCS1基因在人口腔癌KB细胞中呈明显阳性表达，镜下观察见细胞膜/细胞质呈棕黄色(图1、2)。

图1 人口腔癌KB细胞中SOCS1表达呈阳性，细胞膜及或细胞质出现棕黄色(苏木素染色,×200) 图2 PBS对照组SOCS1表达情况，呈阴性，均为细胞免疫化学染色(苏木素染色,×200)

2 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞增殖的影响 siRNA沉默SOCS1基因后24、48、72、96 h，转染组人口腔癌KB细胞增殖率明显低于阴性组(P<0.05)，见表1。

表1 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞增殖率的影响(%)

3 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞凋亡的影响 转染组人口腔癌KB细胞凋亡率高于空白对照组以及阴性组，但空白对照组人口腔癌KB细胞凋亡率高于阴性组(P<0.05)，见表2。

表2 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞凋亡的影响(%)

4 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞侵袭的影响 空白对照组、阴性组、转染组穿膜细胞数依次明显减少，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞侵袭的影响(个)

讨 论

siRNA沉默是近年来日益兴起的基因沉默技术，为临床常用下调基因表达工具，研究证实siRNA沉默可抑制肿瘤细胞增殖、生长及侵袭，有望为肿瘤的分子诊断及基因靶向治疗提供理论依据[5]。目前通过抑制特定基因表达达到抑制肿瘤增殖生长等恶性生物学行为的方法在分子生物学研究中日益普遍，而siRNA沉默技术有操作简单、成本低、周期短及特异性和高效性等明显优势，故而近年来关于siRNA沉默肿瘤特定基因的研究日渐报道[6]。SOCS1基因作为细胞因子信号转导抑制因子蛋白家族中的重要成员，其参与多种类型肿瘤的生成及发展[7]，研究证实SOCS1沉默后，人颊癌细胞的增殖能力明显减弱，肿瘤细胞的侵袭及转移恶性生物学行为被明显抑制[8]。

于鸿等[9]的研究证实，siRNA沉默技术可有效下调脐血树突状细胞中SOCS1的表达，可为肿瘤患者靶向抗肿瘤治疗提供新方向；闫俊等[10]学者文献报告则指出SOCS1基因沉默后，人膀胱癌细胞增殖率及体外侵袭能力明显降低，但化疗敏感性明显增强；因此推测siRNA沉默SOCS1基因对癌细胞的增殖、凋亡及侵袭等过程影响较大[11]，而本文拟通过观察siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞增殖、凋亡及侵袭的影响，以期为口腔癌患者基因靶向治疗提供参考。本结果显示，SOCS1基因在人口腔癌KB细胞中呈阳性表达，且SOCS1基因沉默后24、48、72、96 h转染组人口腔癌KB细胞增殖率明显低于阴性组，初步表明siRNA沉默SOCS1基因可有效抑制人口腔癌KB细胞的增殖能力，同时明显控制口腔癌细胞增殖，利于疾病进展的有效防控[12]，与上述闫俊等学者的研究基本相符。本结果同时显示，转染组人口腔癌KB细胞凋亡率高于空白对照组和阴性组，空白对照组人口腔癌KB细胞凋亡率高于阴性组，而空白对照组、阴性组、转染组穿膜细胞数依次明显减少，初步证实siRNA沉默SOCS1基因可明显促进人口腔癌KB细胞的凋亡，并有效抑制KB细胞的侵袭能力，siRNA沉默可有效下调SOCS1基因表达同时激活有关信号通路，继而明显抑制癌细胞转移，有效减弱口腔癌细胞的侵袭和增殖能力[13-14]，与朱郁文等[15]学者研究指出的干扰人口腔癌细胞株KB中的SOCS1基因表达，可明显抑制KB细胞增殖、侵袭能力的结果基本相符。但不同的是，本文初步证实了siRNA沉默SOCS1基因可有效促进人口腔癌KB细胞的凋亡，分析具体机制为siRNA沉默SOCS1基因后人口腔癌细胞恶性生物学行为被有效的抑制，有望为口腔癌的靶向治疗提供新思路。

综上所述，siRNA沉默SOCS1基因对人口腔癌KB细胞的增殖、凋亡及侵袭能力的影响明显，或可为口腔癌的基因靶向治疗提供参考。但目前关于siRNA沉默SOCS1基因影响KB细胞增殖、凋亡及侵袭作用的确切信号传导通路尚不知，未来研究中可从这一方面完善。