姜黄素介导光动力减菌技术对缢蛏的保鲜效果

林以琳，李世洋，赖丹宁，黄钰婕，胡嘉淼，张志刚，林少玲,※

（1. 福建农林大学食品科学学院，福州 350002；2. 肉食品安全生产技术国家重点试验室，厦门 361000）

0 引 言

缢蛏又名黄蛏（Sinonovaculaconstricta），其质地脆薄，生活在浅海的泥沙中。据2019 年中国渔业统计年鉴[1]表明，缢蛏是贝类养殖中的重要品种之一，至2018 年底，其养殖产量高达85.30 万t。缢蛏肉味道鲜美，营养价值高，是低脂、低热的海洋健康食品而深受消费者青睐。特别是鲜剥蛏肉的上市，因其方便处理且易于加工等特点而日益受到消费者追捧，成为缢蛏产业发展新亮点。但蛏肉中蛋白质和含水率较高，肌肉中结缔组织少，内源性蛋白酶活跃[2-3]，新鲜缢蛏在贮藏过程中易受微生物污染，从而引起变色、变味而腐败的现象，使其丧失营养及食用价值。因此，缢蛏保鲜成为国内外研究人员关注的热点。

目前，缢蛏的保鲜技术主要包括物理保鲜法、生物保鲜法等[4]。物理保鲜法中的低温保鲜技术是在温度低于0 ℃时，对食品进行贮藏保鲜的方法。其主要优点是时间短，对技术要求低，且能有效保持缢蛏新鲜度[5-6]。但低温保鲜对于缢蛏的理化特性有较大影响。生物保鲜法是利用浸泡[7]、喷淋或涂抹[8]等方式，将具有抑菌或杀菌的天然物质应用于食品中，进而达到防腐保鲜效果的方法。研究表明壳聚糖[9]、海藻酸钠[10]、乳酸链球菌素（Nisin）[11]等生物保鲜剂对缢蛏肉具有保鲜作用，能延长缢蛏肉的货架期。但生物保鲜剂的成本较高，在使用过程中存在不良的气味[12]。

光动力减菌技术（Anti-microbial Photodynamic Technology，APDT）是通过光源、光敏剂及周围氧环境共同作用的绿色、安全的非热力灭菌手段。其作用原理是通过光敏剂的靶向性，即光敏剂可优先聚集在有害物质周围，给予适当波长的光照后，光敏剂可吸收光子能量，产生一些活性氧物质；这些单线态氧、自由基通过氧化作用攻击有害微生物，达到杀菌的目的[13-14]。因此，合适的光敏剂、孵育时间及光照时间是光动力减菌技术的核心要素，其对杀菌效果有一定的影响。目前，光动力减菌技术在食品领域已有相关报道，Allend 等[15]证实了由 UV-C 激发的光动力减菌技术能有效延长新鲜草莓的保质期。此外，曹斌斌等[16]以姜黄素为光敏剂，对牡蛎进行光动力减菌技术处理，结果表明，在LED 灯（波长范围420～480 nm）下照射，姜黄素介导的光动力减菌技术能有效杀灭牡蛎中的有害微生物。

光敏剂是光动力减菌技术的核心要素。按其性质可分为第一代光敏剂，如血卟啉；第二代光敏，如卟啉类衍生物 5-氨基乙酰丙酸；第三代光敏剂，如酞箐类。姜黄素（Curcumin）是一种天然的食品添加剂[17]，是世界卫生组织（World Health Organization, WHO）和美国食品药品管理局（Food and Drug Administration, FDA）以及我国批准使用的食品添加剂，具有低毒性、易代谢等特点。此外，姜黄素具有高靶向性及分子识别功能，是一种新型第三代光敏剂。大量研究表明，姜黄素具有抗炎和清除自由基等功效[18-19]；姜黄素已被证实具有多种生理活性，比如其在抗癌方面的药理作用，有望应用于新型抗癌、防癌药物与保健食品的研发[20-21]。

本研究以菌落总数和灭活率为指标，探究光动力减菌技术对缢蛏肉菌落总数的影响，并确定其较佳的姜黄素浓度、浸泡时间和光照时间。其次，结合感官指标和色差、含水率、pH 值、硫代巴比妥酸、挥发性盐基氮等理化指标，比较在4 ℃贮藏条件下保存8 d 的缢蛏肉各指标间差异，探究光动力减菌技术对缢蛏肉品质特性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

缢蛏：从福州金山大润发超市购买，挑选鲜活、完整，质量均在25 g 左右的鲜活缢蛏，购买后将样品置于盐水中浸泡15 min。待缢蛏吐净沙子，用水冲洗多次，直至水中无泥沙。

蛏肉的光动力处理：将开壳后鲜活的缢蛏浸泡在一定浓度的姜黄素溶液中，并给予波长为425 nm，光功率密度为172.8 J/cm2的蓝光下进行光照[22]。

1.2 主要仪器与设备

营养琼脂，北京陆桥技术有限责任公司；食品级姜黄素（纯度≥95%），合肥博美生物科技有限责任公司；全自动色差仪，北京辰泰克仪器技术有限公司；TA-XT2i 质构仪，英国Stable Micro Syestem 公司；SFY-20A 卤素快速水分测定仪，深圳市冠亚电子科技有限公司；MTP-601F全自动荧光酶标仪，天美（中国）科学仪器有限公司；LED通道控制电源，北京卓立汉光仪器有限公司。

姜黄素母液的配置：在黑暗条件下，精确量取食品级乙醇10 mL 加入0.1 g 姜黄素粉末充分混合，制得姜黄素母液。

1.2.1 单因素试验

光敏剂浓度的选择：在黑暗条件下，分别用 0、5、10、20、40、80μmol/L 的姜黄素溶液中浸泡缢蛏 20 min，并在室温于LED 灯下光照20 min。

光敏剂浸泡时间的选择：在黑暗条件下，用40μmol/L的姜黄素溶液分别浸泡 0、5、10、15、20、25 min，并在室温于LED 灯下光照20 min。

光照时间选择：在黑暗条件下，用40μmol/L 姜黄素溶液浸泡20 min 后，分别用LED 灯光照0、5、10、20、30、40 min。

1.2.2 响应面试验设计

选取浓度、浸泡时间及光照时间 3 个因素作为考察变量，以菌落总数为响应值优化光动力减菌技术的工艺条件。通过Design-Expert 8.06 设计试验并分析，如表1所示。

1.3 细菌菌落平板计数

参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定（GB 4789.2—2016）》中提供的方法进行测定[23]。

式中N为空白对照组的菌落总数，lg(CFU/g)；n为光动力试验组的菌落总数，lg(CFU/g)。

表1 响应面试验设计Table 1 Response surface test design

1.4 感官评价

参照《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品（GB 2733—2015）》中对鲜、冻动物性水产品的感官要求进行对缢蛏肉进行感官评价[22]。首先，对光动力减菌技术处理前、后的蛏肉制定感官评价标准，如表2 所示。随机选取 10 名曾参与过感官评价的人员对新鲜缢蛏的外观、色泽、香气、口感4 个感官指标进行评分，每个指标为 25 分，总分为 100 分，以感官指标总分作为最终结果。

表2 缢蛏感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standard of razor clam

1.5 理化指标的测定

含水率测定：按照《中华人民共和国食品安全国家标准 食品中水分的测定（GB 5009.3—2016）》中的相关规定，用卤素快速水分检测仪测定光动力减菌技术作用前后蛏肉中的含水率[24]。

pH 值测定：根据《食品安全国家标准 食品pH 值的测定（GB 5009.237—2016）》中的方法进行光动力减菌技术作用前后的蛏肉的pH 值进行测定[25]。

硫代巴比妥酸（Thiobarbituric Acid，TBA）测定：参照周娇娇等[26]的方法，利用双抗体夹心法，结合试剂盒说明书，对光动力作用前后的蛏肉进行检测。

挥发性盐基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVBN）值的测定：用全自动凯氏定氮仪对光动力减菌技术作用前后的蛏肉进行挥发性盐基氮的测定。

1.6 数据统计分析

所有试验结果均测定3 次，表示为平均值±标准差。采用GraphPad Prism 6 软件对单因素试验进行显著性差异性分析，并绘制相关图表；运用Design-Expert 8.06 进行响应面分析；显著性差异水平选取P<0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 姜黄素浓度对缢蛏肉中菌落总数的影响

由图1a 可知，随姜黄素浓度的增加，光动力处理后缢蛏肉中菌落总数逐渐降低。当姜黄素浓度为0 时，菌落总数为5.19 lg(CFU/g)，当姜黄素浓度为40μmol/L时，缢蛏中的细菌下降了1.14 lg(CFU/g)；相较于未浸泡姜黄素的蛏肉，采用40μmol/L 的姜黄素进行光动力减菌处理后的缢蛏中的细菌的抑菌效果显著（P<0.05），可灭活蛏肉中94.10%的细菌。因此，40μmol/L姜黄素浸泡20 min 结合20 min 光照能够有效抑制细菌生长。

2.1.2 浸泡时间对缢蛏肉中菌落总数的影响

由图1 b 可知，随浸泡时间增加，缢蛏中的菌落总数逐渐降低。当浸泡20 min 后，菌落总数降低了1.54 lg(CFU/g)；相较于未浸泡姜黄素的蛏肉，采用40μmol/L 的姜黄素浸泡20 min 可灭活97.11%的细菌。结果表明，40μmol/L 姜黄素浸泡20 min 结合20 min 光照，能够有效抑制细菌生长。

2.1.3 光照时间对缢蛏肉中菌落总数的影响

由图 1 c 可知，40μmol/L 姜黄素浸泡 20 min 条件下，随着光照时间的增加，缢蛏中的菌落总数逐渐减少。当无光照时，蛏肉中的菌落总数为5.43 lg(CFU/g)；当给与30 min 光照，蛏肉中细菌量下降了2.82 lg(CFU/g)，可灭活99.90%的细菌。结果表明，40μmol/L姜黄素浸泡20 min结合30 min 光照，其灭菌效果较好。

图1 单因素试验缢蛏的抑菌效果Fig.1 Single factor test on antibacterial activity of razor clam

2.2 响应面试验结果

通过 Box-Behnken 试验设计，以姜黄素浓度、姜黄素浸泡时间和LED 灯光照时间为试验因素，菌落总数为响应值所得拟合回归方程：Y= 3.15 - 0.068A- 0.15B+0.059C- 0.25AB+ 0.13AC+ 0.48BC+ 0.070A2- 0.40B2-0.15C2，Y为菌落总数（lg(CFU/g)），A为姜黄素浓度，B为浸泡时间，C光照时间，如表3 所示。ANOVA 方差分析如表4 所示，结果表明P< 0.000 1，该回归模型极显著。此外，R2= 0.9821，表明决定系数可解释98.21%的响应值变化。因此，该模型可以较好的对光动力减菌技术后的菌落总数进行预测及分析。

同时根据所得到的拟合回归方程可发现，其中的一次项B，交互项AB和BC以及二次项B2和A2均达到极显著水平（P<0.01）；此外，一次项A，交互项AC达到差异性显著水平（P<0.05）。由表4 中的F值可判断三因素对缢蛏的菌落总数的影响大小为：B（浸泡时间）、A（姜黄素浓度）、C（光照时间）。该结果提示浸泡时间对杀菌效果具有较大的影响，长时间的浸泡有利于姜黄素在蛏肉内细菌中富集，更有效发挥姜黄素的作用。同时，姜黄素浓度也有显著的影响。但响应面优化时间范围内（20～40 min）光照时间的作用不显著，提示20 min光照即可达到较好的灭活效果。

表3 响应面设计和结果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

表4 回归模型和方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

通过回归模型对最优保鲜工艺进行预测分析，得到响应值Y最大值时的各因素值为A=0.33、B=0.97、C=-0.95，对应各因素的数值为：26.6μmol/L 姜黄素、浸泡时间24.8 min，LED 蓝光光照时间20.5 min。在此条件下，预测姜黄素介导的光动力杀菌技术作用后，蛏肉中的细菌数量为1.862 lg(CFU/g)可灭活蛏肉中99.99%的细菌。为验证该模型的可靠性，根据预测条件进行 3 次平行试验，结果表明缢蛏中的细菌数量为1.743 lg(CFU/g)，说明此模型优化所得结果可靠。

2.3 光动力减菌技术对缢蛏感官评价的影响

新鲜购买的缢蛏口感好，肉质白嫩、紧密，有弹性，呈新鲜海腥味。由图 2 可知，随贮藏时间的延长，空白组缢蛏的评分逐渐下降，当贮藏4 d 时，空白组蛏肉的感官总分为76 分，低于80 分，达到不可食用状态，这可能是由于缢蛏肉中存在的微生物侵入行为，导致缢蛏肌肉组织松软、分解肌肉组织中的蛋白质等营养成分，导致缢蛏出现腐败变质的现象。而光动力组蛏肉的感官总分为87 分，仍表现良好的新鲜水产品状态。在4 ℃下贮藏第 8 天时，空白组蛏肉已腐烂，且出现黑斑、严重的腥臭味，而光动力组蛏肉的外观也开始变黑，出现酸臭味，达到不可食用状态。因此，选用 8 天内不同处理方式下的蛏肉进行理化指标的检测。

2.4 光动力减菌技术对缢蛏含水率和pH 值的影响

由图3 可知，随着贮藏时间的增加，缢蛏的含水率逐渐降低。在贮藏2 d 后，光动力组中缢蛏的含水率降低5.02个百分点，而空白组中缢蛏的含水率降低了10.90 个百分点。当贮藏至第8 天，空白组中缢蛏的含水率相较于光动力组降低了13.85 个百分点。这可能是随着贮藏天数增加，蛏肉出现细胞破裂、细胞液流失等现象；然而，光动力组的缢蛏含水率下降较慢，这可能是光动力作用维持了蛏肉体内的蛋白质网状结构，保持了蛏肉的肌肉组织[17]。因此，光动力减菌技术能够有效的减缓缢蛏水分的流失。

图2 光动力减菌技术对缢蛏的感官评价总分Fig.2 Effects of APDT on the total score of sensory evaluation of razor clam

图3 光动力减菌技术对缢蛏含水率的影响Fig.3 Effects of APDT on water content of razor clam

从表5 可以看出，空白组缢蛏的pH 值随着贮藏天数的增加而升高，这可能是由于蛏肉自身内源酶及细菌的升高，导致其体内蛋白质被分解为氨和胺类物质，进而使蛏肉的pH 值升高[27]。此外，相较于4 d 内蛏肉的pH值，在贮藏4 d 后的蛏肉pH 值的变化程度加快。光动力组蛏肉的pH 值与空白组相比，升高速度较为平缓。因此，光动力减菌技术能够抑制缢蛏在贮藏过程中的腐败速率，能较好保持蛏肉的新鲜程度。

表5 光动力减菌技术对缢蛏pH 值的影响Table 5 Effects of (APDT) Anti-microbial Photodynamic Technology on pH value of razor clam

2.5 光动力减菌技术对缢蛏硫代巴比妥酸和挥发性盐基氮的影响

如图4 所示，硫代巴比妥酸（Thiobarbituric Acid，TBA）是用于评价脂肪氧化的指标之一，其主要原理[27-28]为显色反应，即 TBA 能与脂肪中的分解产物结合，加入丙二醛生成蓝色化合物，最终转化为黄色化合物。随储藏时间的增加，空白组和光动力组的 TBA 值逐渐升高，光动力组与空白组相比存在显著差异（P<0.05）。从图中可知，2 d内，空白组中蛏肉的 TBA 值从 0.093μmol/L 升高至0.257μmol/L，光动力组中蛏肉的 TBA 值从 0.093μmol/L升高至0.195μmol/L；第2 天后，其上升速度均出现减缓现象，且光动力组的 TBA 值均低于空白组。这可能与姜黄素和 LED 光照时间有关；同时姜黄素具有抗氧化性，短时间的蓝光照射减弱了脂质的过度氧化[29]。

图4 光动力减菌技术对缢蛏硫代巴比妥酸的影响Fig.4 Effects of APDT on Thiobarbituric Acid (TBA)value of razor clam

当缢蛏出现品质下降时，其体内微生物和内源酶的作用会引起含氮化合物的降解，如三甲胺、二甲胺等这类含氮物质即总挥发性盐基氮。研究表明，当水产食品的TVBN 值超过25 mg/100g，则不可食用[30]。由图5 所示，在贮藏过程中蛏肉的TVBN 值总体呈上升趋势。4 d内空白组与光动力组中蛏肉的 TVBN 值均未超过25 mg/100g；但空白组在第 6 天的 TVBN 值已经达到25 mg/100g，光动力组在第 8 天的 TVBN 值超25 mg/100g。因此，光动力减菌技术可在一定程度上减缓缢蛏中蛋白质的腐败。

图5 光动力减菌技术对缢蛏挥发性盐基氮的影响Fig.5 Effects of APDT on total volatile basic nitrogen of razor clam

3 结 论

通过探究不同姜黄素浓度、姜黄素浸泡时间和不同光照时间条件的光动力技术对缢蛏菌落总数的影响，确定较佳抑菌参数，并在优化条件下评价蛏肉的感官、含水率、pH 值、硫代巴比妥酸和挥发性盐基氮等指标。结果表明，影响光动力灭活缢蛏中的微生物的显著性顺序为浸泡时间、姜黄素浓度、光照时间。姜黄素介导的光动力减菌技术对缢蛏的优化保鲜工艺条件：26.6μmol/L姜黄素浓度、浸泡时间 24.8 min，LED 蓝光光照时间20.5 min，在此条件下可灭活蛏肉中99.99%的细菌。光动力减菌技术保持了蛏肉的感官品质，又能最大程度保留其营养成分，有效延长了缢蛏的保质期至6 d。同时，光动力减菌技术更好保持了蛏肉的水分，有效减缓了蛏肉的腐败。