羔羊STEC的耐药性、毒力基因和血清型分析

张 凌，佟盼盼，张 毅，马晓玉，张萌萌，刘璐瑶，姚 刚，陈童锦悦，苏战强

(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)通常被认为是一种多种动物都携带的肠道共生菌，但是某些大肠杆菌会导致动物和人类发病和死亡[1]。其中，产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)引发的人类疾病最为严重。新疆作为主要羊肉销量地区之一，关注新疆羊源STEC的携带能力和致病潜力是必要的。【前人研究进展】全世界每年STEC导致3 890例溶血性尿毒症(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)，270例终末期肾病，230例死亡，用于治疗的直接和间接费用超过10亿美元[2]。我国曾在苏皖地区发生过一次STEC爆发[3]，牛被认为是STEC最主要的宿主，而且相关的研究也较多[4]。研究表明，牛之外的许多动物也常常携带并不断排出STEC，最常见的STEC排菌量较多的动物是绵羊、山羊[5]，当然，猪、猫、犬，及野生动物海鸥和鹿等都有携带STEC的报道[6, 7]。【本研究切入点】我国关于羊源STEC的携带情况鲜有报道，只有极少数地区曾经报道从羊粪便中分离到了STEC，而对于羊源STEC菌株毒力基因亚型及耐药性的研究几乎没有。2010年到2014年，新疆人的羊肉消费量约占全国消费量的40%[8]。研究新疆羊源STEC的耐药性和毒力情况，评价羊源STEC在羊产业链饲养阶段的风险。【拟解决的关键问题】研究采集新疆阿克苏地区某规模化养殖场的2月龄羔羊肛拭子，进行羊源STEC的分离鉴定，对羊源STEC的耐药性和毒力基因做了研究，为羊源STEC的致病潜力提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集及处理

2018年10月，于新疆阿克苏地区某规模化养殖场，用生理盐水浸润的无菌棉棒随机采集2个月左右健康杜泊羔羊的肛拭子21份，放入3 mL的EC肉汤液体培养基中，低温带回实验室。之后，在37℃培养箱中培养12 h，再进行STEC和E.coliO157：H7的分离鉴定。

1.1.2 主要试剂与仪器设备

EC肉汤、麦康凯培养基(MAC)，山梨醇麦康凯培养基(SMAC)均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PCR 反应相关试剂(2×Taq PCR Green Mix、ddH2O)，购自新疆宝信生物工程有限公司。

空气浴振荡恒温培养箱(型号 MOD-EL：ST-F160AC)；SW-CJ-2F 双人双面垂直洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；Eppendorf Mastercycler nexus GSX1 PCR 仪；DYY-7C 型电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统TRANSILLUMINATOR JVLABO；高温高压灭菌锅(型号 HVE-50)。

1.1.3 引物设计合成

列出引物序列信息，引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。表1

表1 引物序列

1.2 方 法

1.2.1 STEC的分离鉴定

菌液PCR：用上述1.1.1的EC肉汤培养液做菌液双重PCR(stx1与stx2)，体系为2×TaqPCR MasterMix 7μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，将ddH2O补至12.5 μL。引物参照表1。PCR运行程序：94℃预变性3 min，94℃变性 30 s，59℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。扩增后使用1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察并记录结果。表1

菌落PCR：将菌液PCR检测出有阳性条带的培养液接种于MAC平板上，37℃培养12 h，挑选出5个粉红色的单菌落，取其1/2做菌落双重PCR，将有阳性条带菌落的另外1/2纯化保存。

1.2.2E.coliO157:H7的分离鉴定

使用上述1.1.1的EC肉汤培养液接种于SMAC平板上，37℃过夜培养，次日挑选出具有白色菌落样品的平板，从每个平板中挑选出5个无色的单菌落，接种于MUG培养基中，过夜培养，时间控制在12 h。次日在阴暗无光处使用紫外分析仪，挑选出无荧光的菌液，取一波尔环菌液再次接种于SMAC琼脂平板上，从中选取5个无色单菌落的一半做菌落双重PCR进行初次验证，引物(rfbE与fliC)参见表1。体系为2×TaqPCR MasterMix 7 μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，将ddH2O补至12.5μl。PCR运行参数：94℃预变性3min，94℃变性 30 s，61℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35个循环，72℃延伸10 min。扩增后使用1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察并记录结果。将出现阳性条带的另一半菌落纯化保存。表1

1.2.3E.coliO157：H7是否STEC检测

将分离株E.coliO157：H7做菌液双重PCR，检测是否含有stx1和/或stx2基因，判断是否属于STEC。

1.2.4 耐药性检测

1.2.4.1 菌株来源

受试菌株：分离到的10株STEC，E.coliATCC25922保存于实验室。

1.2.4.2 药敏试验

根据临床用药情况选定18种抗菌药物采用纸片扩散法测定菌株的耐药性。包括氨苄西林(Amp)，阿莫西林/克拉维酸(A/C)，头孢噻肟(CTX)，头孢他啶(CAZ)，头孢吡肟(FEP)，哌拉西林-他唑巴坦(TZP)，氨曲南(AZM)，庆大霉素(CN)，氨苄西林-舒巴坦(SAM)，阿米卡星(AN)，左氧氟沙星(LEV)，环丙沙星(CIP)，四环素(TE)，磺胺甲基异恶唑(SXT)，氯霉素(CHL)，多粘菌素(PB)，链霉素(S)，哌拉西林(PIP)。用电子游标卡尺测量抑菌环直径，根据“革兰氏阴性杆菌药敏试纸盒”使用说明书提供的参考值判定结果。

1.2.4.3 耐药基因检测

通过PCR的方法检测TEM，CTX，SHV3种耐药基因。引物参照表1，使用2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各使用0.5 μL，菌液1 μL，将ddH2O补至25 μL。SHV和TEM基因的PCR运行参数：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30个循环，72℃延伸10 min。CTX基因PCR反应参数：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，50℃退火30 min，72℃延伸45 s，33个循环，72℃延伸10 min。扩增后使用1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并记录结果。

1.2.5 毒力基因与血清型检测

对10株分离菌进行隔夜培养，用煮沸法提取DNA。使用PCR方法检测分离株DNA提取液中ehxA，hlyA，eae，stx1a，stx1c，stx1d，stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2f，stx2g毒力基因，9株STEC检测了O121，O45，O145，O103，O111，O26，O157血清型情况。参照表2的引物参数进行PCR扩增。使用25 μL体系，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各使用0.5 μL，DNA模版1 μL。扩增后使用1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并记录结果。

表2 引物序列

1.2.6 绵羊血平板溶血性检测

使用具有溶血素ehxA与hlyA的菌，在5%的绵羊鲜血琼脂平板上接种划线，37℃过夜培养，观察溶血环结果。

2 结果与分析

2.1 STEC的分离鉴定

研究表明，通过对该养殖场的21份羔羊肛拭子的检测，其中9份样品中检测出了STEC(stx1)，检测率为42.86%。通过山梨醇发酵与MUG试验结合双重PCR的方式，分离到1株E.coliO157：H7，经检测此株菌也属于STEC(stx1)。图1，图2

注：M.DL2000 marker；“-”.阴性对照；“+”.阳性对照(O157：H7标准菌株CICC 21530)；1～9.STEC 菌株PCR扩增图谱；10.E.coli O157：H7株验证为STEC

注：M.DL2000；“-”.阴性对照；“+”.阳性对照(O157：H7标准菌株CICC 21530)；10.E.coli O157:H7 PCR扩增图谱

2.2 耐药情况

研究表明，有2株STEC对头孢吡肟具有耐药性，耐药率为20%。1株STEC对头孢噻肟表现中度敏感，2株STEC对头孢吡肟表现中度敏感，4株STEC对多粘菌素表现中度敏感。使用β-内酰胺类耐药基因检测10株菌的携带情况，没有发现有相关耐药基因。图3

注：S.敏感；I.中介；R.耐药

2.3 毒力基因及其亚型的携带情况

研究表明，除1株E.coliO157：H7以外，其他的9株STEC均不属于O121，O45，O145，O26，O103，O111和O157。10株菌均有stx1基因。其中1株非O157 STEC与O157：H7 STEC菌株携带stx1，ehxA，hlyA3种毒力基因，并且毒力基因亚型均为stx1c。携带了stx1型的菌株60%含有stx1a，70%含有stx1c，40%携带stx1a+stx1c，并没有携带stx1d的菌株。毒力基因分布情况见图6，PCR扩增图谱见图4和图5。使用两株具有ehxA与hlyA的菌液在5%绵羊血平板上并未呈现出溶血环。图4～6

注：M.DL2000；“-”.阴性对照；A：1～10.hlyA基因PCR扩增图谱，B：1～10.ehxA基因PCR扩增图谱

注：M.DL2000；“-”.阴性对照；A：1～10.stx1a 基因PCR扩增图谱；B：1～10.stx1c 基因PCR扩增图谱

图6 毒力基因分布情况

3 讨 论

产志贺毒素大肠杆菌是一类危害严重的人畜共患病原菌[16]。近年来，由非 O157 STEC引起的食物中毒事件持续增长，因此检测致病性大肠杆菌STEC非常重要[5]。羊作为新疆畜牧业发展的优势群体，羊肉在新疆的肉源食品中占有重要地位。关注羊源STEC的流行状况至关重要。国外有许多关于羊源STEC的报道。在西班牙，羊源STEC O157:H7菌株与非O157 STEC菌株的分离率为1.0%与35.0%，也不乏有一些高分离率达到8.7%与50.8%[17]。在德国，从抽样动物中分离出28.9%的STEC菌株，其中最常见的是绵羊和山羊[2]。巴西南部羊群中有50%被分离出STEC[18]。国内胡彬等于2017年与2018年分别在山东某地区报道过两次羊的粪便中检测到STEC，分离率为0.8%与0.0%[19, 20]。江苏某地健康羊粪便分离率为19.4%[21]。而新疆有关羊源STEC的报道并不清楚。研究检测了新疆阿克苏地区某羊养殖场中STEC的携带情况，结果显示该地区羊源STEC分离率达到(9/21)42.86%，远远高于我国已报道地区的分离率。

志贺毒素是STEC主要的致病物质，对细胞具有凋亡作用。志贺毒素分为两类，即志贺毒素1(stx1)和志贺毒素2(stx2)，分别由stx1和stx2基因编码[22]。志贺毒素还进一步分为不同的亚型，包括stx1a，stx1c，stx1d，stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2f，stx2g。不同的志贺毒素型，对人的致病性也有所差异。单独携带stx1的菌株主要引起人的腹泻，罕见引起HUS，而Stx2最易引起HUS[23]。stx2a亚型与人类溶血性肠炎(HC)等疾病密切相关。STEC的毒力表达还与内膜蛋白eae，肠溶血素ehxA和hlyA基因相关，许多作者强调携带eae基因的STEC菌株能引起严重人类疾病，特别是与HUS相关的一些疾病。这种重要的毒力基因在绵羊中只存在很小的比例，但是，内膜的产生与发病机制并没有直接性关系。缺乏eae基因的菌株仍然在美国和澳大利亚产生过3例与HUS有关的病例[24]。ehxA与hlyA基因一般出现在肠出血性大肠杆菌(EHEC)中，EHEC可产生较大毒力，引起人类的血性腹泻[25]。此次研究的10株菌中均检测到了stx1，与山东地区报道的羊源非O157 STEC均为stx2不吻合[20]。毒力基因亚型的组合有40%为stx1a+stx1c组合，这与伊朗地区小牛和山羊及美国的樱桃西红柿携带的亚型组合有相同之处[26, 27]，毒力基因亚型与相关国外羊源毒力基因亚型报道没有较大差异，都以stx1c为主[28, 29]。此次研究中的菌株未携带eae基因，但是有携带ehxA与hlyA基因的菌株。羊源STEC对人的致病风险需要进一步探究。

STEC在不同的地理环境中存在的主要血清型是有所差异的。在巴西地区某羊群中以血清型O76与O65为主，并未发现血清型O157[18]。在澳大利亚，非O157 STEC菌株最常见的血清型是O111与O26，在欧盟，O157，O26，O111，O103和O145是最主要的血清型[2]。在伊朗，主要致病性血清型为O157和非O157 STEC中的O103和O128[30]。目前欧美等国主要检测以O121为代表的血清型“Top Six”[5]。我国对STEC的血清型检测以“Top Six”与O157为主。此次研究的10株菌中，除一株E.coliO157：H7，另外9株菌血清型不属于“Top Six”和O157。羊源STEC中还具有许多血清型与人类的一些疾病密切相关，在已知的 101 种血清型中，23 种是从患有 HUS 的病人中分离到的[21]。所以新疆地区羊源的优势血清型需要进一步的研究。

养殖业对抗生素的不规范使用，会给动物肠道内的菌株带来一定的耐药选择性压力[20]。国外的相关报道显示，绵羊中STEC对链霉素、阿莫西林-克拉维酸和纳利地克酸的耐药率较高。Ghanbarpour等[31]发现绵羊中对青霉素的耐药率较高。在我国，山东省某地区关于羊源STEC耐药性研究结果表明，对磺胺异唑，复方磺胺异唑和萘啶酸，四环素和氯霉素等存在多重耐药现象[19, 20]。研究对10株STEC检测了18种常用抗生素的药敏反应，有2株菌对头孢吡肟耐药，其耐药率为20%，没有发现其他耐药性菌株。针对药敏实验的结果，对10株菌还做了β-内酰胺类耐药基因检测，尚未发现有耐药基因的存在。这说明新疆羊源STEC对目前的抗菌素普遍敏感，反映出新疆羊群良好的养殖环境和较少的抗生素使用。

4 结 论

新疆阿克苏地区某羊养殖场STEC的携带率(42.86%)较高，携带血清型“TOP 7”中O157 STEC分离株；10号O157 STEC与2号非O157 STEC出现在同一样品中；菌株中携带常见毒力基因ehxA(20%)和hlyA(20%)，毒力基因亚型以stx1c(70%)为主，毒力基因亚型以stx1a+stx1c(40%)为主；菌株对药物敏感性高，仅有20%的菌株对头孢吡肟耐药，且未发现耐药基因的存在。结合此结果，羊源STEC具有较弱的潜在致病力，但是O157：H7与非O157 STEC出现在同一病原体上。