桔梗中β-D-葡萄糖苷酶的提取研究

2020-10-21朱学军黄晓巍

人参研究 2020年5期

朱学军*，黄晓巍，王昊，梁静，王虹

(1.吉林农业大学生命科学学院，长春130118；2.长春中医药大学药学院，长春130118）

桔梗（Platycodon grandiflorus）是桔梗科植物桔梗的干燥根，是传统中药常用药，具有止咳，平喘，排脓等功效。研究人员采用现代分析技术对桔梗中小分子进行了分析研究，发现桔梗中主要活性成分为三萜类和黄酮类物质[1-3]。

β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是一类生物大分子，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键。广泛存在于植物、微生物和动物细胞中[4-8]。因此本文以桔梗为原料，以对硝基苯-β-D-葡萄糖为底物，测定在提取过程中酶活力的变化，对桔梗中β-D-葡萄糖苷酶提取主要影响因素进行探索，为中药药物在生物大分子方面的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

桔梗（市售，新鲜桔梗室温通风干燥，粉碎，过40目筛，备用）。

1.1.2 试剂

对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)，上海旭硕生物科技有限公司；对硝基苯酚（PNP），分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

L5S紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶活力测定方法

粗酶液的制备：在一定条件下，将桔梗粉末加入适量稀盐溶液浸提一段时间后，用定量滤纸进行过滤，收集滤液，即为粗酶液。

测定方法[5-7,9]：吸取粗酶液0.1 mL加入0.5 mL pH4.5缓冲液中，于37℃恒温水浴预热5 min，再加入已预热的5 mmol/L pNPG 0.4 mL，精确计时30 min，迅速放入沸水中水浴5 min，流水冷却至室温，吸取0.5 mL反应液加入1 mol/L Na2CO3溶液中，混匀，室温放置5 min，于405 nm处测OD值。

空白对照管中加入0.1 mL沸水处理使酶失活，按上述操作。

试验中以每克桔梗粉末提取的总酶活力为纵坐标作图。

参照文献[10-11],配制1 mmol/L对硝基苯酚溶液，然后用 1 mol/L Na2CO3，分别稀释为 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0 μmol/L。以蒸馏水为空白对照，在405 nm波长处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，对硝基苯酚的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

酶活力定义：在pH4.5，温度37℃，以pNPG为底物，每分钟水解产生1 μmol对硝基苯酚的酶量为1个活力单位（U）。计算公式如下：

式（1）中A：酶活力单位（U/g单位质量原料提取液测定的酶活力）；

C浓：对应于标准曲线上的对硝基苯酚的浓度；

V总：单位质量原料提取液的总体积；

V反：用于酶活力测定提取液的体积；

30：反应时间，单位min

1.2.2 提取温度对酶活力的影响

分别在不同温度下，其他条件固定，提取一定时间后，过滤，收集滤液，按照酶活力测定方法测定酶活力，以温度为横坐标，酶活力为纵坐标绘图。

1.2.3 提取时间对酶活力的影响

分别在不同时间下，其他条件固定，进行提取，收集滤液，按照酶活力测定方法测定酶活力，以时间为横坐标，酶活力为纵坐标绘图。

1.2.4 提取料液比对酶活力的影响

分别按照不同原料质量与提取液体积的比值（m/V），其他条件固定，提取一定时间后，过滤，收集滤液，按照酶活力测定方法测定酶活力，以料液比为横坐标，酶活力为纵坐标绘图。

1.2.5 盐浓度对酶活力的影响

分别使用不同浓度的氯化钠溶液，其他条件固定，进行提取，收集滤液，按照酶活力测定方法测定酶活力，以时间为横坐标，酶活力为纵坐标绘图。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制

对硝基苯酚曲线见图1

图1 对硝基苯酚标准曲线Fig.1 The standard curve of PNP

线性回归方程为，R2=0.9998说明线性关系良好。

2.2 提取温度对酶活力的影响

图2 温度对酶活力的影响Fig.2 Effect of temperature on activity of β-glucosidase

由图2可知，酶活力在温度25～35℃之间随着温度的增加而增大；温度增加有利于酶的溶出，但是温度过高会使酶蛋白变性，使酶活力降低，在35℃以后酶活力随着温度的升高而降低。结果表明，最适提取温度为35℃。

2.3 提取时间对酶活力的影响

图3 时间对酶活力的影响Fig.3 Effect of time on activity of β-glucosidase

由图3可知，酶活力在时间0.5～2 h之间随着时间的延长而增加；在提取时间2 h处酶活力最高，提取时间2～3 h酶活力迅速下降。从结果可知，提取最佳时间为2 h，提取时间短β-葡萄糖苷酶溶出量较低，提取时间过长酶容易受到细菌污染，蛋白酶水解和其他导致酶变性物理因素的影响，使酶蛋白变性同时伴随着酶活力降低。结果表明，最适提取时间为2 h。