小黑杨MYB122基因生物信息学及表达1)

吕冠斌 赵凯 刘悦 姜廷波 周博如

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

植物生长在自然环境中经常受到干旱和盐等逆境胁迫[1]。植物在生长进化过程中进化出复杂的防御机制以更好地适应极端的外界环境。植物受到干旱和盐胁迫，一些基因就会产生应答反应，以降低胁迫造成的伤害[2]。这些胁迫应答基因包括AP2/ERF、MYB、NAC、WRKY、bZIP和bHLH，研究证明其在植物应答胁迫反应中发挥重要的调节作用。MYB家族是最大的转录因子家族之一，包括大约200个具有高度保守的DNA结合域的基因。MYB转录因子在植物体内具有极其广泛的生物学功能，主要体现在参与植物的生长发育[3]、次生代谢产物的合成、激素信号转导、对逆境产生应答[4]以及参与叶片等器官形态建成等。许多研究表明，植物在逆境胁迫下有许多MYB基因参与应答反应[5]。在盐胁迫中，Jung et al.[6]发现拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtMYB44的过表达植株比野生型和其敲除系具有明显的耐旱和耐盐性。低温胁迫下，Agarwal et al.[7]发现拟南芥MYB15过表达植株的耐低温能力减弱，说明MYB15对植物的耐低温能力呈负调控，并且植物中大部分R2R3-MYB蛋白能够影响转基因植株的耐盐能力[8]。小黑杨(Populusimonii×P.nigra)抗寒、抗旱、速生等优良特征可提高中国北方沙荒干旱地区绿化水平，培育小黑杨抗逆转基因植物，提高栽培植物的抗逆性[9]，可以使一些自然条件较差的土地适于种植，进而可以扩大栽培的面积。

1 材料与方法

1.1 植物材料

培养1个月的小黑杨组培苗。

1.2 试验方法

1.2.1 构建pMD19-T-PsnMYB122载体

利用天恩泽柱式植物RNAout试剂盒(北京天恩泽科技有限公司)提取野生型小黑杨RNA，并用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，Dalian，China)将其反转录为cDNA；在杨树数据库中找出MYB122基因序列，根据查找的基因序列设计引物MYB122-F，5′-CTAAGGCACAAGCAGATAGC-3′；MYB122-R，5′-CGTTAGCATTGGAGGTCAAGAGC-3′，以小黑杨的cDNA为模板，MYB122-F和MYB122-R为引物，进行PCR扩增得到目的条带；然后利用胶回收试剂盒对目的条带进行胶回收，将胶回收产物连接于pMD19-T Vector(试剂盒购于大连宝生物公司)载体上并转化大肠杆菌，挑单菌落进行PCR检测并送测序，将测序正确的阳性菌液中1∶1加入体积分数50%的甘油，于冰箱中-80 ℃保存。

1.2.2PsnMYB122基因的生物信息学

利用在线软件Bioxm查找MYB122的开放阅读框(ORF)[10]；利用ExPASy(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)中Protparam程序分析氨基酸的理化性质[11]；使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件对氨基酸进行信号肽预测[12]；利用NCBI数据库Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp)查找MYB122氨基酸序列同源性高的不同物种，利用BioEdit软件Clustal W程序进行多序列比对[13]，并利用MEGA(Version 5.2)Neighbor-Joining Tree进化树构建法进行系统进化树构建[14]。

1.2.3 构建亚细胞定位载体

根据测序成功的MYB122的ORF序列，设计单酶切引物MYB122-GFP-F，5′-CCGGGTCGACTGAATGCTTGGTGTTCG-3′；MYB122-GFP-R，5′-CTCACCATACTAGTGATGCCTGTTTCTCTCA-3′。以pMD19-T-PsnMYB122载体的质粒为PCR模板进行扩增并胶回收，用speⅠ限制性内切酶酶切pBI121-GFP载体质粒，将空载线性质粒与胶回收产物在50 ℃下用In-Fusion高效连接酶进行连接，并用热激法将连接产物转化至大肠杆菌Top10感受态中，37 ℃培养后挑单菌落后送生物公司测序(生工)，获得pBI121-MYB122-GFP的重组质粒，采用基因枪瞬时转化法将重组质粒瞬时转化至洋葱表皮细胞(仪器PDS-1000)，暗培养24～48 h后用激光共聚焦显微镜观察其在细胞中的表达部位[15]。

1.2.4PsnMYB122基因的时空表达测定

将培养1个月的小黑杨组培苗，在60%～70%相对湿度、16 h光/8 h暗、平均温度25 ℃条件下，在水中继续培养1个月后分为24组，每3组施以1种处理。分别用水(对照组)和0.15 mol·L-1(实验室筛选耐盐基因浓度)NaCl处理0、3、6、12、24 h后，分别提取样本的根、茎、叶，液氮速冻后，利用天恩泽柱式植物RNAout试剂盒(北京天恩泽科技有限公司)提取样本组织RNA，并利用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser将其反转录为cDNA，每个处理包含3个生物重复。根据杨树数据库中MYB122基因序列设计避开保守结构域的定量引物MYB122-F，5′-GGAGTTACTGGATGCCAAG-3′，MYB122-R；5′-CCAGGATTTGAGCAGTGTG-3′，以Actin(基因登录号：JM986590)和UBQ(基因登录号：FJ438462)为内参引物进行试验。实时荧光定量RT-PCR反应体系参照荧光定量试剂盒为SYBR®Premix Ex Taq II，在ABI7500荧光PCR仪上进行反应，反应程序为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性12 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，95 ℃延伸30 s；共45个循环，用公式2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

1.2.5PsnMYB122酵母自激活

根据已经测序成功的MYB122基因序列将其拆分成4个不同长度的区段(MYB122-BDFR1含145将其个氨基酸；MYB122-BDF1R含172个氨基酸；MYB122-BDF1R2含112个氨基酸；MYB122-BDF2R含60个氨基酸)，分别设计引物，引物序列见表1，利用引物将基因片段扩增出来，以pMD19-T-PsnMYB122载体的质粒为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行胶回收。将胶回收产物与空载质粒双酶切，并将酶切产物进行胶回收。连接pGBKT7载体，并将其产物进行转化。第2天挑点，单克隆检测，将条带正确的菌液送测序。提取pGBKT7-PsnMYB122质粒，并转化于酵母细胞，将其涂于SD/-Trp和SD/-Trp/-His培养基中。然后放在恒温箱中30 ℃培养3～5 d。挑点于加入X-α-Gal的SD/-Trp中，观察是否变蓝来检测自激活活性。

表1 PsnMYB122构建pGBKT7载体的引物序列

2 结果与分析

2.1 pMD19-T-PsnMYB122载体构建

以小黑杨嫩叶的cDNA为模板进行PCR，连接pMD19-T Vector载体，扩增出1 100 bp左右的条带(图1)。

2.2 PsnMYB122基因蛋白的理化性质

ExPASy ProtParam预测表明，MYB122基因编码氨基酸的数目为317个，相对分子质量39 007.7，理论等电点(PI)为5.87，蛋白质分子式为C1588H1486N460O496S14，不稳定系数为56.47，表明该蛋白为不稳定蛋白。脂溶指数为75.36，总平均亲水性的数值为-0.698，预测该蛋白为亲水性蛋白[16]。

2.2.1 PsnMYB122蛋白质的信号肽预测

使用SignalP 4.1 Server在线软件进行信号肽预测，未发现该蛋白含有信号肽。同时，由于第49位甘氨酸残基原始剪切位点最高分值为0.112，综合剪切位点最高分值为0.109，第12位精氨酸信号肽最高分值为0.148，最后氨基酸加权平均值为0.109远小于0.5，推测不存在信号肽(表2)。

表2 MYB122蛋白的信号肽预测结果

2.2.2PsnMYB122编码蛋白进化树

利用MEGA5.0软件对MYB122氨基酸序列与其他物种中的氨基酸序列进行比对，构建系统进化树。结果表明，MYB122保守结构域序列与其他物种MYB具有很高的一致性(图2)，MYB122和毛白杨(Populustomentosa)、胡杨(P.euphratica)、毛果杨(P.trichocarpa)亲缘关系最近；与橡胶(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)、榴莲(Duriozibethinus)、拟南芥、烟草(Nicotianatabacum)亲缘关系较远(图3)。在线Blast比对结果表明，MYB122编码的氨基酸序列与毛白杨的同源性最高，相似性达到95.90%。

2.3 PsnMYB122基因的时空表达特性

2.3.1PsnMYB122基因枪瞬时转化

利用基因枪将MYB122-GFP融合表达载体和GFP蛋白表达载体对洋葱表皮进行瞬时转化，结果显示在融合蛋白表达载体转化的洋葱表皮细胞核内可见GFP绿色荧光，而阳性对照GFP蛋白表达载体转化的洋葱表皮细胞可见全细胞表达荧光，说明MYB122转录因子定位于细胞核内(图4)。

2.3.2PsnMYB122应答盐胁迫差异表达

MYB122基因表达具有组织特异性，并对胁迫产生应答。在非胁迫条件下，其在根中表达水平比在茎和叶中高，约为茎表达水平的6.306倍，约为叶表达水平的5.897倍。而在茎和叶中的表达水平差距不明显。盐胁迫下，MYB122基因在根茎叶中都表现出先升高后下降的趋势，叶中9 h表达量达到最大，约为对照的8.168倍，根中12 h表达量达到最高，约为对照的8.714倍，茎中12 h表达量达到最高，约为对照的7.710倍(表3)。

表3 盐胁迫下杨树MYB122基因的相对表达量

2.4 PsnMYB122自激活验证

MYB122基因的4个片段中能够转录自激活的均为C端的片段，说明该基因的自激活结构域位于此基因的C端(图5)。随着C端区域片段缩小到60个氨基酸时，转化后的酵母细胞在SD/Trp/X-α-Gal培养基上生长并呈现蓝色，说明MYB122转录因子的自激活结构域在基因的C端1～60个氨基酸间。

3 结论与讨论

MYB转录因子作为植物中功能多样且存在最广泛的转录因子家族，其作用于植物生命过程中的一生，包括植株的代谢活动，细胞的生长分化等。本研究通过PlantTFDB在线网站获取毛果杨MYB122基因的CDS全长，根据其序列设计小黑杨PsnMYB122基因的特异性引物，克隆获得MYB122目的基因。通过在线软件分析发现该基因编码的蛋白质为亲水性蛋白，没有信号肽。将MYB122与其他物种的MYB转录因子进行氨基酸序列比对以及构建进化树分析，发现小黑杨MYB122与毛白杨、毛果杨、胡杨等物种亲缘关系较近。对MYB122转录因子的亚细胞定位研究表明，该基因定位在细胞核，和大部分的转录因子定位结果[17]一致。有研究发现，R2R3-MYB亚族FtMYB13基因通过改变植物的生理和生化反应以及增加胁迫响应基因的表达来增强拟南芥的干旱和盐胁迫耐受性[18]。Tang et al.[19]研究发现水稻(Oryzasativa)OsMYB6过表达转基因植株的抗盐和抗干旱能力较野生型水稻高。在对野生型小黑杨进行盐胁迫处理后取不同的组织进行定量分析发现，胁迫处理后，MYB122基因在根茎叶中表达量都表现出先升高后下降的趋势，根和茎在12 h的表达量达到最高，而叶在9 h的表达量达到最高，推测该基因可能和杨树抗逆胁迫相关。

大部分植物转录因子都有转录调控区和DNA结合区。转录调控区决定转录因子对基因的表达起激活或抑制作用，所以对转录因子激活区域的研究有重要意义[20]。利用转录因子酵母自激活技术来检测该基因具有自激活活性。并且通过分段来进一步检测该基因的自激活区域，将其氨基酸不同区域连接到BD载体上再次进行酵母转化试验，最后得出该基因自激活区域在C端1～60个氨基酸间，这和已有研究证明部分MYB转录因子的转录激活域在其C端结果[21]一致。